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鱼类急性毒性实验设计
一 实验目的及意义
本实验通过观察在不同受试物浓度处理下，鱼的急性中毒表现和经过，了解和基本掌握测定毒物的半数致死剂量/浓度 （LD50/LC50）的方法，了解受试物剂量和生物反应的关系及计算表示方法。
通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。
二 实验原理
鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要
地位。当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24 h、48 h．72h、96 h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50％时的受试物浓度，半数致死浓度用24h LC50、48h LC50、72h LC50和96h LC50表示，并记录无死亡的最大浓度和导致鱼类全部死亡的最小实验浓度。
本实验将经过曝气驯化的鱼（保证其初始状态一致），放入不同浓度的重铬酸钾溶液中进行96hr的观察，记录不同浓度组6、24、48、72和96hr的鱼的死亡率，得出剂量-死亡率曲线，求出不同时间的LC50。
三 实验材料
1）待测化学物：使用实验室剂---重铬酸钾溶液K2Cr2O7（Cr6+, 2000mg/L）溶液、曝气自来水）以及助溶剂（丙酮）。
2) 实验动物：斑马鱼（从鱼市购买）：用曝气后的自来水驯养3天，补充氧气以保证溶解氧的浓度。
3）实验常用仪器设备：温度控制仪 分光光度计 玻璃水槽 抄网（尼龙制，对照和实验容器分用） 气相色谱-质谱联用 pH计(PHS-3B) 溶解氧测定仪(JYD-1A) 水硬度计 温度计 电子分析天平 烧杯（25，50ml） 移液管（1，10ml） 量筒等。
四 实验步骤
1、实验动物的选择。
鱼是水生生态系统的重要组成部分,是人类主要的食物来源,所以,鱼类的急性毒理资料是常用的评价有毒化学物质和工业废水对水生生物危害的资料.
实验鱼类一般选择对污染物敏感，在生态类群中具有代表性，经济价值比较高，来源丰富、取材方便、遗传稳定，生物学背景资料丰富，大小适中，在室内条件下易于饲养和繁殖的种类。
而斑马鱼是国际标准化组织(ISO)推荐的实验鱼种，其个体较小，性成熟期短，繁殖能力强，价格便宜。被广泛的应用于生命科学的研究，也是实验室标准毒理学检验最常用的实验
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动物，所以本实验选用斑马鱼作为实验动物。
2. 实验溶液的制备
以重铬酸钾为实验毒物，实验溶液的母液由蒸馏水配制而成。母液最好每日配各1次，比较稳定的物质也可以两日配制1次，配好后， 最好低温保存。配制好的母液可以稀释为进行毒性实验的溶液，以等比或等对数间距设置浓度系列，相临浓度比值不得超过2.2。
3、实验动物的喂养环境。
(1) 实验用水 使用高质量的自然水或标准稀释水，也可以使用饮用水(必要时应除氯〉。水的
总硬度为10-250mg/L (以CaCO3计)， pH为 6.0-8.5。 (2) 实验周期 96h。 (3) (4) (5) (6)
实验负荷 静态实验系统最大承载量为1.0 g鱼/L。 光照每天 12-16h.
温度与实验鱼种相适宜，变化范围土2℃。
溶解氧不低于空气饱和值的60%。曝气时不能使受试物明显受损。
4、实验动物的染毒实验。 1）预试验：
1般用 3~5 个动物, 实验在2L的烧杯中进行，用对数比例形成的系列浓度, 如 0.01, ○0.1, 1, 10, l00ppm, 同时做一对照（如受试物为废水, 采用体积百分比浓度, 如 0.01, 0.1, 1, 10, 100%)，以确定高锰酸钾对斑马鱼24h100%致死的最低浓度和96h不引起死亡的最高浓度。
2尽可能使LC50在设置的浓度范围内，每个浓度设平行。 ○
3实验开始后每隔一段时间观察记录，整理24h、48h，72h，96h观察记录，需要统计各○
容器试验鱼的存活情况和行为特征，实验观察时发现死鱼需要及时捞出。
4实验数据记录。 ○
表一 ： 浓度/(mg/l) 死亡率/% 0 1 4.5 5.0 7.0 10
2）正式试验：
1试验结束时，对照组的死亡率不得超过10％。 ○
2从预实验得到的无死亡浓度和100%死亡浓度之间，以实验配置好的母液以及稀释水，○
按照一定的间隔设置6个实验浓度组（4.5mg/L, 5.0mg/L, 5.5mg/L, 6.0mg/L, 6.5mg/L, 7.0mg/L）和一个空白对照组（曝气自来水）以及助溶剂（丙酮）对照组，每组设三个平行。
3每组10条斑马鱼，以96h为一个实验周期，采用静水流的方式，在24h，48h，72h，○
96h后分别观察斑马鱼存活状况，并记录溶解氧、pH、温度情况，鱼的死亡情况及行为变化等等（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积等）。还要及时捞出死鱼。
4最终确定鱼死50%时受试物的浓度， ○半数致死浓度用24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、
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96h-LC50来表示，判断斑马鱼死亡需要用玻璃棒轻轻按压斑马鱼的尾部，如果没有反应即认为斑马鱼已经死亡。
4实验数据记录。 ○
表二 24h 死 亡 率 X1 x2 x3 平 浓度 均值 （mg/L） 自来水空白 丙酮空白 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 48h x1 x2 x3 平均值 72h x1 x2 X3 平均值 96h x1 x2 x3 平均值
5根据高锰酸钾对斑马鱼的致死数据计算出其平均死亡率，再转化为概率单位，求出概率 ○
单位与高锰酸钾浓度对数的回归方程，计算出高锰酸钾的LC50，数据记录在表3。 表3 污染物 实验时间/h 相关系数 LC50（mg/L） 高锰酸钾 24 48 72 96
6根据鱼类毒性分级标准，LC50<1mg/l为剧毒，1~100mg/l为高毒；100~1000mg/L为中等○
毒性；1000~10000mg/L为低毒，>10000mg/L为微毒或无毒。再以此判断含该化合物的废水的毒性.，具体参见下表。
关于含高锰酸钾的废水毒性实验,实验设计废水浓度100％、50％、40％、20％、10％、5％和0(CK)7个处理，3次重复。每组废水中均放入10尾斑马鱼,实验周期为96h,开始暴露前,
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试验鱼逐条测量全长和体重,各组之间试验鱼的全长和体重均无显著性差异.采用自然光照,对照组和实验组同时进行试验,试验期间每24h更换一次试液.为防止饵料影响,试验期间不喂食.每两小时观察记录1次斑马鱼的生活作息;分别于4h,8h,12h,24h,48h,96h时统计斑马鱼的死亡率. 表4： 废水浓度 (%) 0 5 10 20 40 50 100 4h 8h 不同实验时间鱼的死亡率(%) 12h 24h 48h 96h
五 数据计算
根据斑马鱼在各观察时间段的死亡率,计算出LC50, SC,MAC和Tua急性毒性特征参数。 (1) 半致死浓度（LC50）：采用概率单位-质量浓度直线回归计算。 (2) 安全浓度(SC):SC=0.1×各观察时段的半致死浓度。
(3) 毒性累积程度（MAC）:MAC=某观察时段的半致死浓度差值/最初观察点与实验结束时的半
致死浓度差值×100%。分析斑马鱼对含A废水的蓄积与降减动态。 (4) 急性毒性单位(Tua)=100%/LC50
(5) 以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死
亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序计算出 6 h、24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度（LC50）值，并计算95％的置信限。
(6) 如果实验数据不适于用标淮方法计算LC50，可用不引起死亡的最高浓度和引起100%死亡
的最低死亡浓度估算LC50的近似值，即这两个浓度的几何平均值。
六 实验结果分析
附：标准稀释水的配制方法
1、制备标准稀释水前先按照下列要求配制4种溶液
(1) 氯化钙溶液 将11.76g CaC12 ? 2H2O溶解于水中，稀释至1L。 (2) 硫酸镁溶液 将4.93g MgSO4 ? 7H2O溶解于水中，稀释至1L。 (3) 碳酸氢钠溶液 将2. 59g NaHCO3溶解于水中，稀释至1L。 (4) 氯化钾溶液 将0.23g KCl溶解于水中，稀释至1L。
2、将这4种溶液各25mL加以混合并用蒸馏水稀释至1L，即配成标准稀释用水。 3、溶液中钙离子和镁离子的总和是2.5mmol/L。 Ca: Mg的比例为4: 1， Na : K 比为10:1。
稀释用水需经曝气直到氧饱和为止，然后储存备用，在使用前不必再曝气。
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鱼的急性毒性实验设计
