实时定量 PCR 应用中的问题及优化方案
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是 一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确 定量的有力工具[1]。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量 PCR 技术取得了突飞猛 进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循 环仪和实验材料。实时定量 PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意 义的定量 PCR 技术，所谓实时定量 PCR 是指在 PCR 指数扩增期间通过连续监测 荧光 信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[2]。目前它 作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅 2000- 2001 年，收录在 Medline 上的以 real-time PCR 为关键词的文章就达一千多篇。实时 PCR 技术较之与以前的以终点法进行定量的 PCR 技术具有无与伦比的优势。首先，它 不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体 系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。 另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增， 即多重扩增[3,4,5]。本文将对实时定量 PCR 目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及 实验条件的优化作一综述。
实时定量 PCR 的应用现状
实时定量 PCR 技术自 1996 年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于 分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到 的范围包括 DNA、mRNA 和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多 个领域[3]。
Giulietti 等人[6]对用实时定量 PCR 测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞 因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常 与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织 样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法 （如 ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用 PCR 定量进 行基因诊断就显得十分有意义。
众所周知，cDNA 微排列和差异表达 PCR 技术是对基因表达变化分析的两种关键 技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。 Rajeevan 等人[7]利用实时定量 PCR 技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有 效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行 检测的新技术。
实时定量 PCR 技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强 了对基因质所发生变化方面的研究。例如 Laird 和他的同事们[8]建立了一种被称作 Methylight 的实时定量 PCR 方法，它能通过特异的引物和/或 Taqman 探针检测基因
CpG 岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时 PCR 的敏感性和特异性，使得这种方法 对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌 病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞[9]。又如 Sevall 等人[10]证明可 以用实时定量 PCR 方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团 标记 Taqman 探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的 杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明 两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。
目前实时定量 PCR 在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒 的定量测定上，这一技术对 DNA 和 RNA 病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册 供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准 曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为 NASBA（nucleic
acid
sequence-based amplification）的技术[11]，它是一种利用电化学以光的等温 PCR 反应， 在反应过程中能产生一种与靶 RNA 反极性的 RNA 扩增子，分子 beacon 常用于这种技 术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。
常用的热循环仪
对 PCR 产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一 个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以 下几种：
1. PE 公司生产的 Applied Biosystem 系列：(1) ABI
Prism 7700 Sequence Detection
System (SDS)是第一种作为商业用途的实时 PCR 测定仪，它由激光激发荧光，并且可在 500-660nm 范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链 DNA 结合染料、分子
beacon 原理的分析。一次可以测定 96 个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要 2 小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分 析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与 ABI Prism 7700 SDS 相同， 但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。(3) ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与 ABI Prism 7700 SDS 相同， 但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96 孔和 384 孔）。如果 加上一个装载辅件，可以在 24h 之内完成 84 个 384 孔板的样本测定。
2. Roche 公司生产的 Lightcycler 热循环仪，它以能装载 20-25ul 的毛细硅管作为反 应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光 激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多 种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重 PCR。由于 Lightcycler 使用了其独特毛细管 反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从 而能在 20-30min 内快速完成 30-40 循环，达到样本扩增的目的[12]。Lightcycler 通常使用 的实验材料主要是 SYBRI Green I 荧光染料和 Taqman 荧光探针和杂交探针。虽然 Lightcycler 有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个 32 孔的样 品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。
3. Bio-rad 公司生产的 iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实 时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成 96 个样 本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。
4. Strategene 公司的 MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在 350-750nm 范围 内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括 Taqman 探针、杂交探针 和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括 96 孔盘、8 联 管或单管，其程序也提供实时数据分析。
5. Cepheid 公司的 Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它 有 16 种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测 四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。 Smart Cycler System 的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将 样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。
6. Corbert Research 公司的 Rotor-Gene: 这种仪器与 Lightcycler 相比，属于中心型 热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在 470nm 处激发 荧光，绿光在 530nm 波长激发荧光；具有两种样品盘（32 孔和 72 孔）供选择；可以对 多种荧光材料进行测定 。
荧光材料新进展
为了满足实时 PCR 更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材 料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几 种：
1.
水解探针或 Taqman 探针：这种探针用于 Taqman 分析法，它能被 DNA 合成酶
(例如 Taq 酶)的 5’?3’活性所降解，探针的 5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭 基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光， 但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生 能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针 5’端相结合的基团有 FAM（6－羧基荧光素）,TET（四氯－6－羧基荧光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二 氯－6－羧基荧光素），HEX（六氯－6－甲基荧光素）或 VIC，常与 3’端相结合的荧光 淬灭基团常为 TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或 DABCYL（4-（4’-恶烷氨基苯偶氮） 苯甲酸）。相较之于 TAMRA，使用 DABCYL 可以更有效的减少自发荧光信号[6]。目前， 水解探针已被用于基因检测[13]、病毒定量[14,15]、癌细胞基因微突变检测[16]、细胞因子基 因定量[17]等，其结果都具有高特异性与高敏感性。
2. 分子信标: 是一种单链 DNA 形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一 端有一淬灭基团[18]，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两 者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET），当热循 环温度达到分子 beacon 的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展成 线性分子，使得 FRET 消失，报告基团发出荧光信号[19,20]。分子信标特别适用于检测点 突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同 DNA 序列，而且其敏感性要远比同等长度
的寡核苷酸探针高[21,22]，分子 beacon 已被用于
突变检测[23,24]、病原体定量[25,26]、病毒检测[27]和胚胎的性别判断[28]，它同时出用于 多重 PCR 检测逆转录病毒[29]。
3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探 针，但是此探针也具有引物的功能[30]。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于 荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。在反应的变性阶段，探针的发夹结 构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭 基团分离而发射荧光。同 Taqman 探针和分子 beacon 相比，scorpion 能更快地发射出荧 光且信号更为强烈[31]，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因， 探针-引物才会与之相结合。Scorpion 是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景[31]。
4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分 别单标，一个携带荧光供体基团，一个携带荧光受体基团，当这两个探针杂交到目的基 因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生 FRET。受体基团能转 移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产 量成相关关系[32]。这一方法已被 Roche 公司生产的 Lightcycler 所应用，进行病原体检 测[33]、病毒荷载量[34]的测定等领域。
5. SYBR Green I: 这是一种 DNA 结合染料，能非特异地掺入到双链 DNA 中去。在 游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链 DNA 中以后，便可以发出荧光[35]。它 的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑， 它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链 DNA 结合，所以一旦 反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性[36]。要避免这 种不利因素，一方面可以通过 Lightcycler 和 Rotor gene、Smart gene 等热循环仪内设定 的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由 PCR 产物和本底造成的荧光信号，另一方面 就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响[37]。
实践中的问题：
实时定量 PCR 已广泛地运用于分子生物学的各个领域，就目前的应用情况来看， 虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直 是争论不休的，本文将就这些问题做出探讨。
1. 方法的选择：研究者在实验中往往想要得到目的基因的绝对量，因为绝对定量对 目的基因的表达差异有直接的反映[38]。绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法，用一 系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准 曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒 dsDNA，体外转 录的 RNA，或者是体外合成的 ssDNA[39]。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进 行扩增，使用的荧光材料可以是杂交探针、水解探针或是 SYBR Green I。有研究表明[40]， 这一方法的动力学范围可以达到 9 个数量级，远比终点法的要高。这一方法虽然简便， 但是为了得到可靠的实验结果，有两个先决条件必须等到满足，一是所选用的标准品必
须与目的基因的扩增效率一致，要达到这个要求，需要标准品同目的基因的同源性尽可 能的高，不仅长度相似，而且其碱基组成也尽量相同；二是要尽可能地优化实验条件和 模板的准备过程。就标准品而言，实践中有外参照和内参照之分，作为外参照的标准品 与目的基因不在同一反应体系中进行扩增，所以它无法检测也不可能补偿可能出现在目 的基因反应体系中的影响因素，如 PCR 抑制子[41]。事实上，在绝大多数的实验中，要 想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的。为了弥补单独使用一个标准品 作为外参照的不足，研究者便引入一个内参照同目的基因在同一反应体系中同时进行扩 增，以反映体系中可能出现的 PCR 影响因素，此即所谓的竞争性 PCR。竞争性 PCR 所 使用的内参照具有与目的基因序列相同的引物结合位点，但不具有相同的探针结合位点 [42]。关于内参照的设计，有多种方法可供选择，例如向目的基因序列中引入插入或缺失 突变[43]，改变目的基因中的某些核苷酸[44]，设计不同的限制性酶识别位点[45]，也可以 用非特异的间隔基因或间隔 DNA 作为内参照[46]。竞争性 PCR 设计的原理在于内参照 与目的基因相互竞争反应的原料，所以两者的量应当相互匹配，如果一方的拷贝数大大 的高于另一方，那么拷贝数多的一方就会在反应体系中得到优先扩增，而拷贝数少的一 方则扩增受到抑制，定量也就不能有效地进行。由于使用了内对照，所以一旦体系中存 在干扰 PCR 扩增的因素，就会通过内对照的扩增效率的变化反映出来，目前使用的实 时定量 PCR 仪都是以扩增曲线上 crossing point 的漂移来体现扩增效率的变化的。竞争 性 PCR 由于能够消除反应体系中干扰因素的影响，所以它所等到的结果要准确可靠得 多，但是由于在反应体系中同时扩增两种模板，使得其结果的测定范围比单使用外参要 大为缩小，往往只有 2-3 个数量级[40]。正是由于竞争性 PCR 有利有辟，所以研究者应 根据不同的情况决定是否使用内参照。
在目前的研究中，大多数研究者选择使用绝对定量的方法，但是也有学者[47]认为在 当前的条件下，绝对定量具有难以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀释浓度的标 准品不仅费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在 260nm 波长下定量的 方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结 果的稳定性。（2）标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而 每次配制新的标准品又会增加批间差异。（3）每次测定样本都要同时测定标准品，而热 循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时 PCR
的高通量有所降低。（4）由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与
目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的 DNA（或 cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。鉴于以
上原因，这些学者强烈地推荐使用相对定量的方法，所谓相对定量是指在测定目的基因 的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷贝数的比 较；（2）作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因 变异，以及反映反应体系内是否存在 PCR 扩增的影响因素；（3）标准化标本[47]。由于 管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以以管家基因的定量来作为某种标准以比 较样本来源不同的目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有 GAPDH 、β- actin、β2-微球蛋白和 rRNA，研究者也可以根据具体的需要而选定合适的管家基因。 使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得
荧光定量PCR应用中的问题及优化方案
