中革１ｓＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｄＨｅｒｂａｌＤｒｕｇｓ第３７卷第４期２００６年４月·６０７－不同产地三花龙胆地下器官龙胆苦苷的测定马立祥，肖玮，王臣１５００２５）（哈尔滨师范大学生物学系，黑龙江哈尔滨产自东北的龙胆草药材商品俗称“关龙胆”，由于产量大、质量佳，在国内外颇负盛名，具有传统的市场优势。三花龙胆ＧｅｎｔｉａｎａｔｒｉｆｌｏｒａＰａｌｌ．是关龙胆３种原植物之一，生于湿草甸、林间空地或灌丛中。历史上，南于三花龙胆主要生于湿地及苔草草甸，难以采挖，加之外观质量较差，野生资源没有受到严重破坏。近年来，随着“关龙胆”供需矛盾的加剧以及人们对野生药材的偏好，三花龙胆的采挖量快ｍＬ／ｍｉｎ；紫外检测波长２７０ｎｍ，理论塔板数按龙胆苦苷峰计算不低于９０００，柱温４０（：。２＋２对照品溶液的制备：精密称取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成含６ｔｘｇ／ｍＬ的溶液，作为对照品溶液。２．３供试品溶液及阴性对照液的制备：精密称取三花龙胆样品５０．０ｍｇ，置５０ｍＩ，量瓶中，加人７０％乙醇约４５ｍ１．，超声提取３０～３５ｒａｉｎ，冷却至室温，７０％乙醇定容，混匀，取约５ｍＩ。放入离心管中，２５００速提高，而且已经成为野生“关龙胆”药材的主体。为了保护和开发利用野生三花龙胆种质资源，笔者对ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ。精密吸取上清液ｌｍＬ，加三花龙胆进行了系统的野生变家植研究。本实验采用高效液相色谱法对不同产地的野生三花龙胆根及入到１０ｍｌ，量瓶中，用流动相稀释并定容，混匀，经０．４５“ｍ微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。用７０％乙醇作阴性对照液。根茎中龙胆苦苷进行测定，以探讨原生地条件与主要药效成分量之间的关系，为引种栽培研究选择优良种质提供依据。１仪器、试剂与材料１．１仪器：Ｗａｔｅｒｓ１５２５高效液相色谱泵，Ｗａｌｅｒｓ在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照液与供试品溶液各５ｐＬ，注入液相色谱仪，测定，得到龙胆苦苷对照品溶液、阴性对照液与供试品溶液的色谱图（图１）。２．４标准曲线的制备：精密称取龙胆苦苷对照品１０．０２４８７紫外一可见光检测器，ＥｍｐｏｗｅｒＰｒｏ工作站，Ｎｏｖａ—ＰａｋＣ，Ｒ柱（１５０ｉｉｌｍ×３．９ｍｍ），ＡｎｋｅＴＤＬ一５ｍｇ置于２５ｍＬ龟瓶中，以甲醇溶解并定容至型离心机，Ｓａｒｔｏｒｉｕａ５ＣＨ型柱温箱。ＢＳ２１０ｓ电子天平，ＷａｔｅｒＣｏｄｅ刻度，摇匀制成质量浓度为０．４０ｍｇ／ｍＩ。的对照品贮存液。精密吸取上述贮存液０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍｌ，加入到１０，０ｍＩ。容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀并进样。每一质量浓度平行进样３次，进１．２试剂：龙胆苦苷对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯（美国迪马公司），乙醇为分析纯，水为超纯水。１．３材料：在传统的药材采收期（花、果期），采集不同地区的三花龙胆（经哈尔滨师范大学生物系刘鸣远教授鉴定）各１０～１５株，带回实验室内，将药材部分（根及根茎）取下洗净泥土，吸净附水，分开每株的根和根苹，合并同一采集地的根与根茎，置通风处阴Ｔ。样量为５止。以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标绘制标准曲线。回归方程为：Ｙ＝７．２０×１０６ｘ１．９６×１０３，ｒ：：＝０．９９９６７，表明龙胆苦苷在０．００４－－０．０２０ｍｇ／ｍｌ。具有良好的线性关系。２．５精密度试验：精密吸取２．３项下供试品溶液５ｐＬ，重复进样６次，测定峰面积积分值，ＲＳＤ为０．９６％。用研钵研唐备份样品，过４０目筛，根粉备用，测试前再用变色硅胶干燥一周。采集地点和时间见表１。２方法与结果２．１色谱条件：Ｎｏｖａ—ＰａｋＣ。。色谱柱（１５０３，９ｎｌｎｌ×２．６稳定性试验：精密吸取２．３项下供试品溶液５ｆ－Ｌ，分别于制备后０、２、４、６、８、１０、１２ｈ进样进行测定，结果供试品溶液中龙胆苦苷在１ＲＳＤ为４．１％（ｎ一７）。２ｈ内稳定，ｒａｍ）；流动相：甲醇水（２５：７５），体积流量：１．０收稿日期：２００５０６１２箨妻藩界；鸯孝舞骞篓妻写笃妻羹耄登奢器晏釜芰：蔷磊漭器量善；霉；象争煮善专萋孳霜碰；麓陈簦品范大学，同年留校任教，主要从Ｅ—ｍａｉｌ：Ｍ１，Ｘ８８＠ｓｉｎａ事药用植物生物学研究。Ｔｅｌ：（０４５１）８８０６０６２５ＣＯｎｌ 中草菊ＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｄＨｅｒｈｌＤｒｕｇｓ第３７卷第４期２００６年４月ｎ—Ｊ，、８ＬＪ４５３４５３４５，／ｍｌｎａ龙胆苫苷ａ—Ｋｅｎｔｌｏｐｊｃｒｏｓ】ｄ。图Ｉ对照品（Ａ）、阴性对照（Ｂ）和样品（ｃ）ＨＰＬＣ图谱ＦｉｇｌＨＰＬＣＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅ（Ａ），ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂ）．ａｎｄｓａｍｐｌｅ（Ｃ）２．７重现性试验：精密称取三花龙胆根粉（６号样品）５０．０ｍｇ，共５份，按２．３项下方法制备成样品溶液，测定龙胆苦苷质量分数，结果ＲＳＤ为１．６％。２．８加样回收率试验：精密称取已知量的三花龙胆根粉（６号样品）样品６份，分别精密加入龙胆苦苷对照品溶液，按２．３项下方法制备样品溶液并进行测定。计算加样回收率，结果平均回收率为９８．１９％，ＲＳＤ为４．２２％。２．９样品测定：三花龙胆样品按２．３项下方法制备样品溶液，结果见表１。表１不同产地三花龙胆根茎殛根中龙胆苦苷测定结果（ｎ一６）Ｔａｂｌｅ１ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｔｊｏｐｉｃｒｏｓｉｄｅｉｎｒｈｉｚｏｍｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆＧ．ｔｒｉｆｌｏｒａｆｒｏｍｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈａｂｉｔａｔｓ（Ｈ一６）３讨论３．１不同产地三花龙胆药材中龙胆苦苷的量存在一定差异，其中采自凤凰山山顶湿地的药材量最高。观察发现，采自凤凰山山顶的三花龙胆植株年龄通常都在１０年以上，根茎上保留的不定根为１～７龄， 其他采集点的植株一般为３～６年。可见“高龄”三花龙胆植株药材的龙胆苦苷量较高，量与年龄成正相关。３．２植物次生代谢产物的种类和分布通常表现出明显的种属、器官、组织及生育时期的特异性。１］。本实验５个不同采集地点的药材，均表现为根茎中龙胆苦苷量明显高于根，说明根茎和根的器官异质性影响龙胆苦苷的量。文献报道，地上茎与根茎属于同源器官，而地上茎中龙胆苦苷量却很低，二者相差为１７．５倍０１．根茎作为地上器官与不定摄的过渡结构，其龙胆苦苷的量却明显偏高。３．３自然条件下，三花龙胆生于草甸子、林缘或疏林中。草甸子（湿地）主要特点是土壤水分充足，根际温度较低，不利于根系的发育。采自黑龙江尚志市老山镇林缘的药材龙胆苦苷量高于“踏头”湿地，并且林缘植株的地下器官（包括根和根茎）发育也好于湿地上的植株。可以认为，林缘的土壤条件较好而有利于根系的发育和龙胆苦苷的积累。３．４有报道指出，来自哈尔滨郊区的二年生三花龙胆药材（未说明生产条件：栽培或野生）龙胆苦苷量随采集时间不同而变化，波动幅度在９．４５％～１６．３０％；另有报道指出（亦是来自哈尔滨郊区，未说明生产条件），随采收期不同龙胆苦苷量在９，４５％～１７．３４％“］。龙胆苦苷作为一种次生代谢产物，量如此之高其意义何在呢？同时，野生药材的测定结果也与前述报道的相去甚远，可见环境差异和采收期不同可以显著影响龙胆苦苷的积累，但量的差异如此悬殊值得进一步研究。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ：ＥｉＪＰ吣ｃｏｌＹａｈｘＦ．Ｅｃｏｌｏｇｙｏｔｐ／ａｎｔ３ｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ！Ｊ］．＾盯“Ｓｉｎ（植物生态学报），２００１，２５（５１·６３９—６４０．［２］ＳｈｅｎｚＢ，ＷａｎｇｘＬ，ＬｉＪＦ，ｅ／ｎ，．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｔｉ。ｐｌｃｆｏｓｉｄｅｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＧｅｎｔｉａＴｌａｔｒｉＪｌｏｒａＰａｌｌ．（Ｇｅｎｔｌａｎａｃｅａｅ）ＥＪ７．ＣｈｉｎＴｒａｄｉｔＨｅｒｂＤｒｕｇｓ（中草药），２００３，３４（３）：２７２—２７３．Ｅｓ］Ｉ．ｉｎｚＹ，ＹａｏＬＮ．ＹａａＧＨＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｔｌｏｐｌｃｒ。ｓＬｄｃｉｎＣｍｎｔｉａｎａｔｒｉｆｌｏｒａＰａｌｌ－ｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｆｉｓｏｌｌｓ［ＪｊＲｅｓＰｒａｃｔｉｃｅＣｈｉｎＭａｄ（现代中药研究与实践）．２００４．１８（４）：３７３８．ｗｘ，ＳｈｅｎｚＲ，ＸｕｅＢＹ．ＳｔｕｄｙｏｆａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｒｅｇｕｌａｒｏｎｇｅｎｔｉｏｐｉｃｒｏｓｉｄｅｏｆＧｅｎｔｉａｎａｔｒｉｆｌｏｒａＰａｉｌ．ａｎｄ（；．ｍａｎｓｈｕｒｉｃａＫｉｔａｇ＜Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）［Ｊ］．ＣｈｉｎＴｒａｄｉｔＨ盯＾Ｄｒｕｇｓ（中草药），２００４，３５（５）：５２卜５２２．［４］Ｊｉａｎｇ
不同产地三花龙胆地下器官龙胆苦苷的测定
