第7章
蛋白质分离、纯化和表征
第七章
1．掌握蛋白质的酸碱性质。
2．掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。
3．掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。 4．掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 5．熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。
6．掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。
第七章作业
1．测得一种血红素蛋白含0.426%铁，计算其最低相对分子质量。一种纯酶按重量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸2.48%，问其最低相对分子质量是多少？
2．超速离心机的转速为58000r/min时，（1）计算角速度w，以每秒的弧度（rad/s）表示；（2）计算距旋转中心6.2cm处的离心加速度a；（3）此离心加速度相当于重力加速度“g”的多少倍？
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3．一种蛋白质的偏微比容为0.707cm/g；当温度校正为水时，扩散系数（D20，w）为
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13.1×10-7cm/s；沉降系数（D20，w）为2.05 S，20℃时水的密度为0.998g/cm。根据斯维德贝格公式计算该蛋白质的相对分子质量。
4．指出从分子排阻层析柱上洗脱下列蛋白质时的顺序。分离蛋白质的范围是5000到400000：肌红蛋白，过氧化氢酶，细胞色素c，肌球蛋白，胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白（它们的Mr，见表7-4）。
5．在第4题中所述的从分子排阻层析柱上洗脱细胞色素c，β-乳球蛋白，未知蛋白和血红蛋白时，其洗脱体积分别为118，58，37和24ml，问未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白质都是球形的，并且都处在柱的分级分离范围内。
6．在下面指出的pH下，下述蛋白质在电场中向哪个方向移动，即向正极，负极还是不动？（根据表7-2的数据判断）。（1）卵清蛋白，在PH5.0；（2）β-乳球蛋白，在PH 5.0和7.0；（3）胰凝乳蛋白酶原，在PH5.0，9.1和11。
7．（1）当Ala，Ser，Phe，Leu，Arg，Asp和His的混合物在PH3.9进行纸电泳时，哪些氨基酸移向正极？哪些氨基酸移向负极？
（2）纸电泳时，带有相同电荷的氨基酸常有少许分开，例如Gly可与Leu分开。试说明为什么？
（3）设Ala，Val，Glu，Lys和Thr的混合物PH为6.0，试指出纸电泳后氨基酸的分离情况。
8．配置一系列牛血清清蛋白（BSA）稀释液，每一种溶液取0.1ml进行Bradford法测定。对适当的空白测定595nm波长处的光吸收（A595）。结果如下表所示：
BSA的浓度/（mg×mL-1） A595 1.5 1.0 0.8 0.6 1.4 0.97 0.79 0.59
0.4 0.37 0.2 0.17 BSA浓度对A595作图得标准曲线。E.coli的蛋白质提取液样品（0.1ml）测得的A595的0.84。根据标准曲线算出E.coli提取液中的蛋白质浓度。
9．今有一种植物的毒素蛋白。直接用SDS凝胶电泳分析（见第7章）时，它的区带位于肌红蛋白（相对分子质量为16900）和β-乳球蛋白（相对分子质量37100）两种蛋白之间，当这个毒素蛋白用β-巯基乙醇和碘乙酸处理后，在SDS凝胶电泳中仍得到一条区带，但其位置靠近标记蛋白细胞色素c（相对分子质量为13370）。进一步实验表明，该毒素蛋白与FDNB反应并酸水解后，释放出游离的DNP-Gly和DNP-Tyr。关于此蛋白的结构，你能作出什么结论？
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各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。 等电点要用等电聚焦等方法测定。
第一节 蛋白质的酸碱性质
第二节 蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量
假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。
例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。
解：按照Leu的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。
按照Ile的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。
由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：
X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。
这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：
7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。
二、渗透压法测定相对分子质量
三、沉降分析法测定相对分子质量
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基本原理：
（一）离心力(centrifugal force，Fc)
当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：
F=m·a=m·ω2 r
a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。
（二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF)
由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。
RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
F离心力m?2X?2X(2?n/60)RCF?????XF重力mgg980 ?1.118?10?5?n?X。
X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（revolutions per minute，简写成r/min，或rpm）。
（三）沉降系数(sedimentation coefficient，s)
根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义，颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
杨建雄生化789章
