羊水细胞培养及染色体制备的影响因素综述

羊水细胞培养及染色体制备的影响因素综述

羊水细胞染色体核型分析是目前诊断胎儿是否有染色体疾病的较为安全可靠及常用的方法[1]，但羊水细胞培养一直存在着标本难以复得、 培养周期长、 易污染、 分裂象少等问题[2-4]。羊水从抽取后进行培养，到制备出可分析的良好染色体核型，整个过程步骤繁多；其中包括羊水细胞接种、培养、收获，及羊水染色体制片、G显带、染色等过程，每一个步骤都对实验的成功具有重要的影响。因此，分析羊水细胞培养和染色体制备的影响因素以及探索提高实验成功率和质量的方法，对满足临床需求和提高染色体异常诊断率有着深远的意义。本文结合本人的工作积累和目前羊水培养和染色体制备的关键环节进行综述，现综述如下： 1.影响羊水细胞生长的因素 1.1羊水细胞的采集时间

孕14～24周的羊水细胞培养均有可能成功，但以孕18～22周最好[5]， 此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，羊水增长速度较快，细胞易于培养，且对胎儿的损伤最小。羊水细胞为来自于胎儿体表、呼吸道、消化道和泌尿生殖道的脱落细胞，死细胞约占95%，需要在无菌环境、适当温度、湿度和酸碱度等条件下经过细胞培养，使活细胞数目增多进而进行染色体核型分析。不同孕周的羊水细胞培养成功率不同。宋莉[6]回顾性分析了120例羊水细胞：其中孕周<18周的羊水细胞共35例，培养失败4例，成功率88.6％；孕周在18～22周的羊水细胞共62例，失败0例，成功率100％；孕周>22周的羊水细胞共23例，失败2例，成功率91.3％。郑娇，李春艳等[7]认为孕周偏小(<18周)，羊水里游离细胞量较少，活性细胞也较少，离心后可见很少量沉淀，接种后需要适当延长培养时间，较正常细胞晚2～3天换液。反之，大孕周(>26周)羊水里细胞较多，但活性细胞较少，培养成功率降低。可在离心后稀释羊水浓度，分多瓶培养促进羊水细胞贴壁。对于孕周过大且含有大量胎脂羊水，须在培养4天后显微镜下观察，如有细胞贴壁须提前换液，才能提高培养成功率。 1.2羊水的性状

羊水培养失败的主要原因就是细胞集落过早地老化或成纤维细胞过多，传代后集落细胞变性，形成巨长梭形细胞，使得收获时不能得到足够的分裂相，而血细胞、血液中的某些成分以及胎脂、胎粪等都是引发细胞集落过早老化以影响羊水细胞培养的因素。羊水细胞培养中会遇到不同性状的羊水标本，如羊水中混有大量胎脂、胎粪、大量的新鲜血液或宫内的陈旧性出血，羊水可呈绿色、红色或褐色等不同的颜色，此时细胞培养难度大。国内有文献报道，不合格的羊水（如血性羊水、混有胎脂或胎粪、离心后沉淀物过少等）的细胞培养成功率仅为78%[8]。曾艳，范佳鸣等[9]报道血性羊水出现率低于国外血性羊水出现率，认为羊膜腔穿刺时出现血性羊水有时难以避免，主要有穿刺针碰到了脐带或胎儿、胎盘位置以及反复进针导致母体血流入羊膜腔中等。故在培养中，当羊水中混有大量血块时，可将离心后黏附在血块表面的细胞振荡脱落等处理后接种进羊水培养瓶，多次换液并剧烈振荡以减少血凝块和血细胞贴壁对染色体收集制片的干扰。血色羊水和茶色羊水在培养中会有大量细胞沉淀贴在瓶底，影响染色体的收集制片，一般进行两次换液等处理来提高培养成功率。 1.3羊水细胞的采集、接种、培养

羊水细胞的采集是由临床医生在B超引导下经羊膜腔穿刺，用无菌注射器先抽取1～2ml左右弃去，然后分别用2支10ｍl无菌注射器(美国BD公司生产的)，抽取20ml羊水标本分装到2支无菌离心管（美国Corning公司生产的）中，送至无菌培养室以1000r/min，离心

10min后，吸弃上清，将羊水及细胞沉淀物留取约2～3ml左右，用无菌移液管将其吹打均匀，分别接种于两个已加有4ml羊水培养基（以色列BI公司生产的羊水专用培养基）的无菌斜面培养瓶（美国Corning公司生产的）中。于37℃5％CO2培养箱中静止培养7d后，在倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况；有成堆和散在的梭形细胞贴壁生长，进行换液，隔天观察细胞生长情况，如见细胞增殖旺盛，分裂细胞多，梭形羊水细胞胞体发亮，折光性好，细胞

之间连接不过密，收缩变圆细胞成倍增多（处于分裂期细胞的细胞形态由梭形收缩变圆），此时即可收获。如细胞增殖不同步，见到有7～9个大克隆即可传代，传代细胞可同步增殖，传代后继续培养，在倒置显微镜下每天观察，2～3天后见到细胞密度合适，有梭形羊水细胞胞体发亮，此时，细胞处于指数增生期，抓住这一时期，及时进行收获。羊水细胞接种要严格无菌操作，其接种是在超净台的酒精灯火焰区进行，接种时无菌操作是否规范，直接影响细胞培养成败，操作时，手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜，离火焰太近，羊水细胞可能被破坏，太远，污染的机率又增高[10]。接种前，需将羊水底物吹散，若未吹散，易导致后期细胞克隆生长不同步，有的克隆密度稀，细胞量少；有的克隆密度高，已老化，难以确定并且容易错过收获的最佳时机，易导致收获的染色体标本分裂相少，影响诊断的准确性。接种时，留有少量的羊水上清和羊水细胞培养基混匀，过多的培养基羊水细胞不适应，贴壁慢并且易污染。细胞培养箱的温度、湿度和CO2浓度以及高质量的羊水培养基是羊水细胞培养成功的前提和关键。细胞培养箱内温度稳定在(37±0.5)℃；在其内底部放置水盘，并加灭菌水2/3至全盘，保持其内湿度在95%左右，使培养箱内成为饱和湿度环境[11]；箱内CO2浓度必须控制在(5±0.5)﹪，这直接影响到羊水细胞是否能够生长存活的必要条件。 2.羊水细胞的收获 2.1秋水仙素时间与浓度

秋水仙素可破坏分裂细胞中的纺锤体结构，使分裂细胞不能进入分裂后期和末期而滞留于中期，从而在培养细胞群中积累大量的中期细胞供染色体制备用。收获时在培养终止前加入秋水仙素，而加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。秋水仙素的用法通常遵循：秋水仙素浓度高，则处理时间短；浓度低，则处理时间延长。加入的秋水仙素过量、作用时间过长，染色体浓缩，不利于分析；若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短，则染色体细长或无染色体，同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适当的作用时间，才能获得较好的分裂象。因各实验室条件不同，加入的秋水仙素浓度及时间略有差异，韩兆东等[21]每瓶加秋水仙素(20μg/ml)40μl，37℃培养箱继续培养1小时，获得的染色体长短适中，易于分析。刘颖慧等[13]在羊水收获终止前3～4h加入200μl 10μg/ml的秋水仙素，得到较为满意的染色体分裂象。我中心经过实验积累认为，收获终止前40min加入50μg/ml的秋水仙素50μl，制备的染色体可用于分析的分裂象多，长度适宜。 2.2低渗处理

低渗处理是获得分散良好分裂相的关键步骤。0.075mol/L的Kcl溶液是目前用于染色体制备最广泛应用的低渗液。低渗是利用细胞内K+浓度大于细胞外K+浓度，使细胞吸水膨胀，从而中期染色体铺展均匀。由于羊水细胞少，羊水细胞染色体制备的低渗时间和手法的把握相对外周血来说又显得格外重要。低渗处理时间过长，细胞膜往往过早破裂，导致分裂细胞丢失，或染色体丢失；低渗处理时间不足，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析[14]。低渗操作应特别注意不要用力，要尽量快地将细胞打散，使羊水细胞充分与低渗液接触。我中心采用常规的0.075mol/LKcl溶液5ml，低渗15min，用3ml尖滴管快速吹打细胞10～12次，获得足够数量的分裂中期细胞。若低渗时间短或者配置的浓度不适，细胞沉淀会出现大的颗粒状，载玻片上类似絮状物，整个玻片无法分析。 2.3细胞固定

固定的目的是杀死细胞同时保持细胞原有的形态结构，以防止离心时细胞间的相互黏连，也是制备良好分散、形态好的染色体标本的重要步骤。目前常用固定液是甲醇和冰醋酸3∶1的混合液，固定液每次使用前必须新鲜配制，否则将会形成酯类，使染色体形象模糊，周围有胞质背景，从而影响制片效果。研究认为，染色体标本制备过程中，预固定剂的用量是最终影响染色体分散质量的重要因素之一[15]。在预固定环节，不同的预固剂量对标本染色体分散质量有明显的影响，随着预固定剂量的加大，细胞问相互黏连明显，较难用气泡吹打均匀，制片时细胞易于成团，所得标本的质量差。在较低的预固定剂量下，染色体的分散程度较好。细胞固定过程中，尤其是预固定中，每一步的吹打要适度，过重会导致细胞破裂，收

不到分裂相，过轻，染色体分散不满意。我实验室通过经验积累，使用预固定的剂量为1ml，预固定时轻轻吹打6～8次，以后每次固定轻轻吹打3～4次，可得到较为满意的染色体分裂相。

3.羊水染色体制片 3.1滴片

滴片质量的好坏也是染色体制备中影响染色体形态的关键一步。滴片的距离、玻片温度、洁净度和底物浓度都会影响结果。首先滴片高度要合适，以5～10cm左右为宜，高度过高有悬液飞溅，可能会污染其他标本及滴不到玻上致细胞流失的可能。其次一般实验室使用冰冻4h以上的冰片，滴片时现用现拿，若冷冻不够，使细胞难以贴附在玻片上，会影响染色体的分散和分带效果。最后是滴片用的玻片要非常洁净，可将玻片提前泡入浓硫酸的酸缸内，以除去玻片表面的油渍和杂质，冲洗干净后放入冰箱冰冻备用。滴片时将混匀的细胞悬滴在载玻片上，滴片前根据离心管内羊水细胞底物来决定滴加新鲜固定液的量，细胞浓度要适中，浓度过大，染色体不分散，过小使玻片上的分裂象数目不足，也不利于临床诊断的需要。 3.2烤片

适当的烤片时间和温度也是获得高质量染色体的必然条件。羊水标本烤片时间过长会导致染色体难以染上色；时间过短，则显带效果不好，染色体带纹不清晰，影响诊断。烤片温度过高，胰酶显带时间也随之增加；若烤片温度过低、时间过短，标本的老化程度不够，不能很好地把握胰酶时间。参考我实验室环境条件，滴片后置80℃烤箱中烤片2.5h。 3.3显带

染色体显带方法很多，其中G显带方法较简单，带纹较清晰、精细，制片可长久保存，应用广泛[16]。羊水染色体G显带易受胰酶浓度，温度及PH值影响。显带过程中胰酶浓度直接影响染色体带纹，浓度过大，不宜把握好显带时间，显带时间过短可引起消化过度，染色体边缘有毛刺，带纹融合到一起难以计数染色体；浓度过小，显带时间过长，带纹不清楚，无法进行染色体结构的分析。这不仅影响工作效率，也影响标本的显带质量，而使显带达不到最佳效果。G显带消化过程中胰酶的最适温度以37℃效果最好，温度越高，作用效力越强,处理时间缩短,但难掌握，温度太低，酶效力差，较难显带[17]。康过秦[17]研究认为，胰酶pH值以 0.1 N的氢氧化钠调pH到6.5左右（37℃即胰酶中加指示剂后调呈桔黄色）,显带效果最佳。pH过高，染色体消化过度发毛、中心变空或呈鱼骨状；不调pH值不显带。也有研究认为由于羊水细胞标本细胞量较外周血少，对胰酶的耐受性差，故消化时间相对于外周血标本应短一些。本实验室采取制片后80℃烤片2.5h，用2.5%胰酶1ml加入49ml生理盐水中，配置成胰酶消化液，加入5%碳酸氢钠调pH值到6.5，于37℃恒温水浴锅内处理15～20s，染色后得到染色体效果良好。

综上所述，羊水细胞培养及染色体制备过程中，影响因素众多。由于各个实验室之间环境不同，操作步骤差异较大，目前尚无统一的染色体制备标准。所以需根据各种因素采用相应的解决措施，通过严格遵守实验流程，优化实验细节，保持实验环境温湿度的恒定，并加强对技术人员的培训，不断完善实验工作，以提高羊水细胞的培养成功率，制备出满足临床需求且质量优良的染色体片。 参考文献

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