EGF和TGF-α对舌鳞癌细胞周期调控的信号通路研究

EGF和TGF-α对舌鳞癌细胞周期调控的信号通路研究

杨学文△，张军峰*，许冬青，董 伟，詹 瑧*

【摘 要】［摘 要］目的：研究EGF和TGF-α调控舌鳞癌细胞周期分布的信号通路。方法：不同浓度EGF和TGF-α作用体外培养的舌鳞癌细胞株TCA-8113，流式细胞仪检测细胞周期分布，细胞免疫组化法研究p38-MAP kinase、c-myc、c-fos和NF-κB在舌鳞癌细胞中的表达水平。结果：EGF和TGF-α效应类似，与对照组相比，G1／G0期细胞比例下降，S期细胞比例增加，p38-MAP kinase、cmyc和c-fos表达水平下调，NF-κB p65表达水平上调，但量效关系不同。EGF和TGF-α分别上调和下调NF-κB p50表达。结论：EGF和TGF-α对舌鳞癌细胞周期分布的影响差异与NF-κB相关，NF-κB可能与舌鳞癌发生关系密切。

【期刊名称】南京医科大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2010(030)004 【总页数】6

【关键词】［关键词］EGF；TGF-α；舌鳞癌细胞；细胞周期；信号通路 口腔鳞状细胞癌是世界上第8大恶性肿瘤，舌鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma of the tongue）是最常见的口腔鳞状细胞癌，严重危害患者的生命及生存质量［1－2］。在肿瘤形成过程中，皮下结缔组织细胞及其分泌的许多细胞因子对上皮细胞的恶性转化和肿瘤的形成起着重要作用，可以影响上皮细胞的表型、增殖和凋亡［3］。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF） 和转化生长因子-alpha（transforming growth factor alpha，TGF-α）同属表皮生长因子家族，对上皮细胞的增殖、分化具有重要意义［4］。前期研

究不同舌苔的舌鳞癌周围正常黏膜组织基因表达谱，发现TGF-α mRNA表达差异显著，而未发现 EGF mRNA 表达差异［5－6］，提示在舌鳞癌发生、发展中EGF和TGF-α的功能不同。因此，以舌鳞癌细胞株TCA-8113为研究对象，比较EGF和TGF-α对舌鳞癌细胞周期分布的影响，为深入研究EGF和TGF-α在舌鳞癌形成中的临床意义提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

青霉素（山东鲁抗公司），硫酸链霉素（大连美罗公司），胰蛋白酶（南京生兴公司），RPMI-1640培养基 （Gibco公司，美国），新生小牛血清（兰州民海公司），碘化丙啶（PI，Sigma 公司，美国），EGF（Sigma公司，美国），TGF-α（Peprotech 公司，美国），6 孔培养板（Corning公司，美国）。p38-MAP kinase多克隆抗体、c-fos多克隆抗体、c-myc多克隆抗体 （武汉博士德公司），NF-κB p50和 p65单克隆抗体（SANTA CRUZ公司，美国），即用型SABC免疫组化染色试剂盒（小鼠／兔IgG）和DAB显色试剂盒为武汉博士德产品。

超净工作台 （苏州苏净公司），CO2培养箱（Thermo 公司，美国），倒置显微镜（X41，Olympus公司，日本），酶标仪（POWERWAVE340，Bio-Teck 公司，美国），流式细胞仪FAC SCantoTM及分析软件ModFit LT 3.0（BD 公司，美国）。 1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪检测细胞周期分布

舌鳞癌细胞株TCA-8113，南京医科大学口腔医学研究所提供，用含10%小牛

血清的RPMI 1640培养基常规培养，长成单层细胞后制成1×105个／ml细胞悬液，转入6孔板，37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱培养，以RPMI1640全培养基培养作为对照，用不同浓度EGF和TGF-α作用TCA-8113，设EGF组、TGF-α组和对照组，经过 16、32和 48 h后，用0.25%胰蛋白酶溶液消化贴壁细胞，用PBS洗涤离心细胞1 000 r／min离心3次，每次 10 min，75%冷乙醇固定，－20℃保存，3个月内完成FCM检测。实验重复4次。

取乙醇固定的细胞，400目尼龙网过滤除去聚集的细胞，收集单细胞，1 500 r／min 离心 10 min，然后用PBS重悬细胞，1 000 r／min离心10 min，洗2次，细胞用 0.1 ml PBS 重悬，加入 50 μg／ml的 PI染液50 μl，避光15 min以上。流式细胞仪检测，ModFit LT 3.0软件分析结果。 1.2.2 细胞免疫组织化学检测

将 TCA-8113制成 1×105个／ml的细胞悬液，接种至96孔细胞培养板，18～24 h长成单层后，更换含不同浓度EGF和TGF-α的RPMI1640培养基，设EGF组、TGF-α组和对照组，8 h后终止培养，严格按照说明进行免疫组织化学细胞检测，不加一抗作为阴性对照。实验重复4次。

在倒置显微镜下用Olympus DP70摄像系统进行拍照，恒定光强，400倍，每孔选择2～3个视野，每个视野不少于100个细胞，每个浓度拍摄照片不少于8张。 1.2.3 图像处理

将图像输入数码医学图像分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司）的 “Motic Med 6.0病理软件（A）”，选择“免疫组织化学图象分析”模块，