水浴锅预热，然后用枪头地轻轻地搅动混匀，放入65℃水浴锅水浴45分钟，其间缓慢翻转几次。
⑤供检样品如果是种子加入600微升酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），缓慢颠倒EP管30次以上，12000转离心10分钟。如果是叶片，则加入600微升氯仿：异戊醇（24:1），缓慢颠倒EP管30次以上，10000转离心10分钟；抽提两次。
⑥将上清液移入新的EP管中，加入上清液等体积的异丙醇（20℃预冷），1/10体积醋酸钠，轻轻翻转EP管，至观察到有白色絮状沉淀时，放置10分钟。10000转离心10分钟，弃上清。
⑦加入700微升70%乙醇洗涤沉淀，然后离心5分钟，弃上清，放在通风橱里，干燥和通风一段时间，直到酒精的味道完全消失。
⑧加入200微升ddH2O，放在4℃冰箱，溶解DNA，并保存。 （3）PCR扩增
利用26对核心引物（附录C），分别扩增待检样品的20个单株。
①PCR反应体系：PCR反应体系见表1，依次向PCR管中加入反应试剂并混匀。
表1 PCR的扩增反应体系（10μl）
试剂 超纯水 模板DNA Buffer dNTP 正向引物 反向引物 Taq DNA 聚合酶
表2 SSR标记的PCR扩增程序
步骤 预变性 变性 退火 延伸 延伸 保存
温度 95℃ 94℃ 52～57℃ 72℃ 72℃ 25℃
时间 45s 30s 45s 32个循环 1min 10min 至取出 用量 5.7μ1 1.0μ1 1.0μ1 0.2μ1 1.0μ1 1.0μ1 0.1μ1
②PCR扩增程序：将PCR管放入PCR仪中，按表2中的程序进行扩增。
（4）PCR扩增产物的检测
①将干净的玻璃板装入电泳槽，1.5%的琼脂粉溶液用微波炉加热溶化，封槽。 ②配置8%聚丙烯酰胺凝胶，迅速灌入玻璃板间，灌胶时要平稳，防止产生气泡，灌好后将梳子插入两玻璃板之间。待胶凝后，注入电泳缓冲液，然后竖直
向上拔掉梳子。
③用加样枪点样，每个泳道点样量为1.2微升。
④打开电泳仪电源，将电压调为260V，电泳时间为40分钟。
⑤关闭电泳仪，倒掉缓冲液（可重复使用），卸胶。用枪头在凝胶上做好标记后，将胶块放入纯净水中固定。
⑥向盛胶的方盘中倒入0.1%硝酸银溶液，放置摇床上晃动8分钟，然后倒掉染色液。
⑦将2%NaOH溶液和甲醛按100:1的体积比混合，倒入方盘中，摇床晃动5分钟，显现出清晰条带为止，用纯净水冲洗一遍。
⑧取出凝胶平铺在X光读片机上，记录带型。带型占比较多的记为“1”，其他带型的记为“2”、“3”或“4”。
4.常规品种纯度的计算
供检样品扩增带型为“3”的，即为该品种的特征带型，其他的则为异型带。统计多态性引物扩增带型为“1”的数目占总检样品所有多态性带型的比例，即为供检样品的种子纯度。计算公式如下：
常规品种纯度=带型为“1”的带型数/供捡样品所有带型总数×100%。
棉花DNA提取液配方
试剂 葡萄糖 1.（pH8.0） 0.5 M EDTA（pH8.0） 10%PVP
β巯基乙醇(Liquid) 超纯水
终浓度 0.35M 0.1M 0.005M 2% 1%
每500ml用量 34.68g 50 ml 5ml 100ml 5ml
定容至500ml
棉花DNA裂解缓冲液配方
试剂 NaCl
1.0 M （pH8.0） 0.5 M EDTA（pH8.0） 10%CTAB 10%PVP
β巯基乙醇(Liquid) 超纯水
终浓度
每500ml用量 40.91g 50ml 20ml 100ml 100ml 5ml
定容至500ml
1.4M 0.1M 0.02M 2％ 2％ 1％
用于陆地棉杂交种纯度鉴定核心引物
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 引物 NAU2083 NAU2265 NAU3995 HAU1300 NAU6960 DPL0811 TMB1618 BNL3257 BNL1317 DPL0431 NAU5428 NAU4926 CGR5390 NAU3820 NAU2343 BNL1026 HAU2786 TMB1638 NAU1102 BNL3948 DPL0376 CGR6410 BNL3140 NAU3515 BNL827 DPL0057 正向引物序列 AGAAGAGGTTGACGGTGAAG CAATCACATTGATGCCAACT CTGACTTGGACCGAGAACTT GGGAGGCAAGTTTGATTAGA CAAATCCATGCTAGAGAGTA CCGCTAGGCTTGAGTAAGAATAGA GGGAATTGAACCCAAGACCT CAATCTGGGATCAAAAAAACC AAAAATCAGCCAAATTGGGA CTATCACCCTTCTCTAGTTGCGTT CTCAGAGTGAAGGAGGAGGA CGCCTCTGTATTCGATTCTC GCGAGATCTTAGCCGGTTT CTTCTCAAAGCCATGAAGGT GCTTTGCTTTGGAATGAGAT TTGGGATGTTTCCAAACGTT AGAATGGCATCTGAAGGCGAGA AAAACCAAGAATCGAGGAAAAA ATCTCTCTGTCTCCCCCTTC GTAATGTTCAACACTTTGCTATTCC GACAGTCATAAACACCATCGACAT GAGTTCGGACCTCAATCGAC CACCATTGTGGCAACTGAGT GTTGGTGCCATTGTTGAATA AAGCTCCACGTGCTCAAGTT AGTTGCACAGCTGTAAGGGTATTT 反向引物序列 TGAGTGAAGAACCTGCACAT CGGTTAAGCTTCCAGACATT AAGAGCCCTGGACAATGATA TCGAAATGATCAAGTGTTGG ATAGGGTTCATAGGTTTCTT GGCTGTCTTTGTTGTTGTGAGTTA GTGAAAGGGGAGGTTCAACA GGTGAAACATAGCGTGTTGC CGTCAACAATTGTCCCAAGA ATCGGGCTCACAAACATCA CTTCTTTCCTTTCCCCATTT GCGTAAATAAAGCGAAAACC ATCCATTGCATTGAGCTTCC AGGATCCAGATTTCTGGTGA ATACTGCAACCCCTCACACT AAGCAATTTGACCGACAACC GGGTCGTTTTGTGCCACTGC TGCAATCCTCGAAGGTCTTT GCATATCTGGCGGGTATAAT GTTGGTTGGGTGAGCAGAAT TTACATCTCTGACACGGAACACTT AAGCCGTCATCCAACAACAG GGAAAAGGGAAAGCCATTGT CCTTCCAATGTGCTCTTCTT CTCATGTTGTCGGTGGTGTT CCATTAATGCCTGCTACTCTTCTT 染色体 Chr.1 Chr.2 Chr.3 Chr.4 Chr.5 Chr.6 Chr.7 Chr.8 Chr.9 Chr.10 Chr.11 Chr.12 Chr.13 Chr.14 Chr.15 Chr.16 Chr.17 Chr.18 Chr.19 Chr.20 Chr.21 Chr.22 Chr.23 Chr.24 Chr.25 Chr.26
SDNYGC-2-6016-2018
棉花杂交种SSR标记法纯度鉴定技术规程
编 制 人：张军 王宗文 陈煜 刘国栋 张传云 张景霞 周娟 杜召海 高阳 孙绪英 王芙蓉 孔凡金 王景会 王桂峰 秦都林 刘明云
所在单位：山东棉花研究中心 山东棉花研究中心试验站 山东省棉花生产技术指导站 滨州市棉花生产技术指导站
1.术语 （1）SSR标记
SSR（Simple sequence repeat）是一类由2～6个碱基组成的基本单元串联重复而成的DNA序列。由于不同品种间SSR基本单元串联重复的次数不同，形成了品种间SSR标记的多态性。
（2）杂合带
是指杂种F1代单株DNA扩增后呈现的带型是父母本带型的集合。 2.原则
通过制定SSR分子标记棉花杂交种纯度鉴定技术规程，建立科学规范的杂交种纯度鉴定技术体系，以确保检测结果准确性、可靠性，为提高棉种质量、维护棉种市场秩序、保障棉花产业健康发展奠定基础。
3.操作步骤 （1）样品制备
待检测样品及其父母本的种子或者是幼嫩叶片。 （2）DNA提取
①分别从父母本样品中随机抽取5粒种子，室温条件下浸泡20小时左右，剥掉种皮，每粒种仁取1/5，混合在一起，或随机采集5个单株的叶片，取1/5大小，约0.2克，混合；供检样品F1代杂交种随机抽取种子20粒，浸泡20小时左右，剥掉种皮，或20个单株的叶片，分别将单粒种子或单株叶片放入2毫升离心管中，加入钢珠，向EP管内加入700微升预冷的提取缓冲液（DNA提取液配方见附录A），利用振荡器打碎。冰浴10分钟。
②放入离心机，7200转离心10分钟，弃上清。
③向沉淀中加入600微升l裂解缓冲液（DNA裂解缓冲液配方见附录B），65℃水浴锅预热，然后用枪头地轻轻地搅动混匀，放入65℃水浴锅水浴45分钟，其间缓慢翻转几次。
④供检样品如果是种子加入600微升酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），缓慢
颠倒EP管30次以上，12000转离心10分钟。如果是叶片，则加入600微升氯仿：异戊醇（24:1），缓慢颠倒EP管30次以上，10000转离心10分钟；抽提两次。
⑤将上清液移入新的EP管中，加入上清液等体积的异丙醇（-20℃预冷）1/10体积醋酸钠，轻轻翻转EP管，至观察到有白色絮状沉淀时，放置10分钟。10000转离心10分钟，弃上清。
⑥加入700微升70%乙醇洗涤沉淀，然后离心5分钟，弃上清，放在通风橱里，干燥和通风一段时间，直到酒精的味道完全消失。
⑦加入200微升ddH2O，放在4℃冰箱，溶解DNA，并保存。 （3）PCR扩增
利用26对核心引物（附录C），首先在父、母本间筛选出扩增产物为共显性条带且条带清晰稳定的多态性引物3对，然后再利用筛选出的3对多态性引物扩增父母本和待检样品。
①PCR反应体系：PCR反应体系见表1，依次向PCR管中加入反应试剂并混匀。
表1 PCR的扩增反应体系（10μl）
试剂 超纯水 模板DNA Buffer dNTP 正向引物 反向引物 Taq DNA 聚合酶
用量 5.7μ1 1.0μ1 1.0μ1 0.2μ1 1.0μ1 1.0μ1 0.1μ1
②PCR扩增程序：将PCR管放入PCR仪中，按表2中的程序进行扩增。
表2 SSR标记的PCR扩增程序
步骤 预变性 变性 退火 延伸 延伸 保存
温度 95℃ 94℃ 52℃～57℃ 72℃ 72℃ 25℃
时间 45s 30s
45s 32个循环 1min 10min 至取出
（4）PCR扩增产物的检测
①将干净的玻璃板装入电泳槽，1.5%的琼脂粉溶液用微波炉加热溶化，封
SDNYGC-2-6-2018棉田病虫草害绿色防治技术规程 - 图文
