改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验检测铜绿假单胞菌产金
属酶表型
严育忠，范惠清，郑文龙，杨焕章，陆燕春，石 毅
【摘 要】摘要:目的 评估改良亚胺培南-乙二胺四乙酸(EDTA)纸片增效试验在检测铜绿假单胞菌(PA)产金属酶表型中的应用价值。方法 收集95株耐碳青霉烯类药物PA，采用琼脂稀释法测定所有菌株对亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度(MIC)值，聚合酶链反应(PCR)和DNA测序鉴定金属酶基因型，亚胺培南-EDTA纸片增效试验常规法和改良法检测金属酶表型。结果 95株耐碳青霉烯类药物PA对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为100.0%和71.6%;常规法敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是100.0%、96.6%、72.7%和100.0%，而改良法均为100.0%。结论 改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验可能是一种检测PA产金属酶表型的有效方法。 【期刊名称】检验医学 【年(卷),期】2014(000)001 【总页数】4
【关键词】关键词:金属酶;铜绿假单胞菌;纸片增效试验
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种医院感染的重要条件致病菌。近年来产金属酶PA在我国呈广泛播散的趋势，广泛耐药PA感染率逐年增多[1]，产金属酶PA感染患者的死亡率也在逐年上升[2]。因此及时检测产金属酶PA对合理使用抗菌药物及控制病原菌播散非常重要[3-5]。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)是一种应用比较普遍的金属酶抑制剂，但其是通过膜渗透作用来增加细菌对抗菌药物的敏感性。因此目前普遍
采用的纸片增效试验出现了较高的假阳性率[6-7]。我们将这一方法进行改良，先提取待测菌株酶液，去除了菌膜的影响因素。在试管内预先将EDTA和酶液进行反应，以大肠埃希菌(ATCC 25922)为指示菌，观察亚胺培南-EDTA纸片增效试验检测金属酶表型的效率。
材料和方法
一、材料
1.试验菌株和质控菌株 (1)试验菌株:收集2010年1至12月上海市浦东医院临床分离的对碳青霉烯类药物(亚胺培南和/或美罗培南)耐药PA 95株，试验前所有菌株经Vitek 2 Compact全自动鉴定系统重新鉴定;(2)质控菌株:大肠埃希菌(ATCC 25922)，PA(ATCC 27853)。
2.抗菌药物及标准品 药物敏感性纸片[亚胺培南(10 μg)纸片和美罗培南(10 μg)纸片]购于英国Oxoid公司，亚胺培南粉剂为杭州默沙东制药有限公司商品，美罗培南标准品为卫生部中国生物制品药品鉴定所标准品。
3.试剂及仪器 EDTA为Sigma公司商品，Vitek 2 Compact全自动鉴定系统(法国生物梅里埃公司)、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(日本TaKaRa公司)、电泳槽、凝胶成像系统(美国BIORAD公司)和加热仪等。引物由上海生工生物工程有限公司合成，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。 二、方法
1.药物敏感性测定 采用琼脂稀释法测定所有菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations，MIC)值，浓度范围为 0.125 ～128 μg/mL，试验操作与结果判断均按美国临床实验室标准化协
会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准[8]进行。 2.EDTA纸片增效试验检测金属酶 (1)常规方法:参考文献[9]，以0.5麦氏单位待检菌菌液均匀涂布在水解酪蛋白胨琼脂平板，中间贴亚胺培南药物纸片2张，其中一张亚胺培南药物纸片上加0.1 mmol/L EDTA 溶液 10 μL，纸片间距＞4 cm，35℃过夜培养，结果以△=d(亚胺培南+EDTA)-d(亚胺培南)≥5 mm为阳性;(2)改良法:①酶液制备，将待检菌株接种在水解酪蛋白胨肉汤中增菌，离心收集细菌，用0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗后制成一定浓度的细菌液，再用冻融法(-70℃快速冷冻和37℃水浴快速解冻，反复5次)破碎菌细胞，使其菌体内的酶释放出来，再离心(22000×g，1 h)去除细菌碎片，收集上清液即为酶液粗提物;②反应液制备，上述酶液和EDTA以4∶1的比例制备，以0.5麦氏浊度单位的大肠埃希菌(ATCC 25922)菌液均匀涂布于水解酪蛋白胨平板，分别贴亚胺培南、亚胺培南+EDTA(10 μL)、亚胺培南 + 酶液(10 μL)和亚胺培南+反应液(10 μL)4张纸片，纸片间距＞4 cm，35℃过夜培养，亚胺培南和亚胺培南+EDTA 2张纸片为空白对照，结果判断以△=d(亚胺培南+反应液)-d(亚胺培南+酶液)≥5 mm为阳性。
3.PCR扩增 煮沸法提取细菌DNA模板，扩增 IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、SIM-1、SPM-1、GIM共7组金属酶基因，所需的引物序列和PCR反应条件均按参考文献[10-11]进行。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并照相。PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行双脱氧链末端终止法测序，结果在GenBank上查询。 三、统计学方法
药物敏感性试验结果用WHONET5.4软件进行统计分析。以PCR检测结果为
改良亚胺培南-EDTA纸片增效试验检测铜绿假单胞菌产金属酶表型
