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绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

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绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

背景知识

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成,长2.6kb;GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr,其蛋白性质十分稳定,能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.

实验一 质粒DNA的分离与纯化

一、实验目的

掌握一种最常用的质粒DNA提取方法:碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA,比较方便、省时,提取的质粒DNA质量较高,可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。 二、基本原理

质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止,从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子,分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制,因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质粒,有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严,称为松弛型质粒,它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白

质合成受到抑制时(例如经氯霉素处理),细菌染色体虽不再增加,但松弛型质粒DNA可继续被复制,以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能,它们往往带有一些抗药标记,当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时,转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型,例如,把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后,原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征,可证实质粒已转入宿主细菌中,这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,它们都包括三个基本的步骤:细菌的生长和质粒的扩增;菌体的收集裂解,质粒DNA的分离;质粒DNA的纯化。

1、 细菌的生长和质粒的扩增

从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落,接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒(如pUC系列)来说,只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期,就可以大量提取质粒,而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒(如pBR322)来说,则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行选择性扩增。

2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离

质粒分离的基本原理是利用宿主菌(一般是大肠杆菌菌株)DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异:(1)大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。(2)从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子,而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理:在细菌悬浮液中加入SDS(十二烷基硫酸钠)和NaOH使菌体裂解(有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁)。此处理可破坏碱基配对,故可使细菌的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时(如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH),质粒DNA链迅速得到准确配对,重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心,可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来,而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。

3、质粒DNA的提纯

对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA,达到纯化的目的。

质粒DNA分子具有三种构型:共价闭合环形DNA(cccDNA,SC构型)、开环DNA(OC构型)和线性分子(L构型)。在细菌体内,质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同,但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA,其后依次是L DNA和OC DNA。

三、实验材料、仪器及试剂

1. 在含有pEGFP-N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种,置于含有5mL LB培养基的试管中。

摇晃过夜。 (DH5α是一种大肠杆菌的诱变菌株,主要表现对外源DNA的免疫缺乏,是用于基因工程的菌种)

在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中,同样摇荡培养过夜。 2、使用仪器

恒温培养箱,超净台,恒温摇床,制冰机,台式离心机,小型混合器,冰箱 四、实验步骤

1. 取1.5ml DH5α培养液倒入1.5mL eppendorf 管(一种离心管)中, 13000rpm离心1min。 2. 重复1。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外显子组成,长2.6kb;GFP是由238个氨基酸所组
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