豆制品、火锅、麻辣烫等食品中喹诺酮类化合物的测定
BJS 201909
1 范围
本标准规定了豆腐、豆干、火锅底料、麻辣烫底料及火锅和麻辣烫的食材中诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星的高效液相色谱-串联质谱检测法。
本标准适用于豆腐、豆干、火锅底料、麻辣烫底料及火锅和麻辣烫的食材中诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星的测定和确证。 2 原理
采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取样品中的喹诺酮类化合物，经离心和过滤
后，上清液经HLB固相萃取柱净化后，用高效液相色谱-串联质谱仪检测和确证，内标法定量。
3 试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 3.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 3.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 3.3 甲酸（CHOOH）：色谱纯。 3.4 甲醇（CH3OH）。
3.5 氨水（NH4OH）：浓度25%～28%。 3.6 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8·2H2O）。 3.7 柠檬酸（C6H8O7·H2O）。 3.8 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。 3.9 氢氧化钠（NaOH）。 3.10 盐酸（HCl）：含HCI 38%。 3.11 乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。
3.12 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取71.63 g磷酸氢二钠（3.8），用水溶解并定容至1000 mL。
3.13 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：称取21.01 g柠檬酸（3.7），用水溶解并定容至1000 mL。 3.14 Mcllvaine缓冲溶液：将1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液（3.13）与625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液（3.12）混合，用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0±0.1。
3.15 EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠（3.6）至1625mL Mcllvaine缓冲溶液（3.14）中，超声使其溶解。
3.16 5%甲醇水溶液：取5 mL甲醇（3.4），用水稀释至100 mL。
3.17 25%氨水甲醇溶液：取25 mL氨水（3.5），用甲醇（3.4）稀释至100 mL。
3.18 标准品：标准品中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见附录A表A.1，纯度≥99%。
3.19 标准储备液配制：分别精密称取标准品（3.18）约10 mg，置10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3），超声使溶解，用乙腈（3.1）定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，转移至溶剂瓶中于-18℃以下避光保存，有效期6个月。
3.20 混合标准溶液的配制：准确吸取标准储备液（3.19）1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成浓度为0.01 mg/mL的混合标准溶液（环丙沙星、沙拉沙星浓度约0.015mg/mL），于4℃以下避光保存，有效期3个月。
3.21 混合标准中间溶液的配制：准确吸取混合标准溶液（3.20）1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成浓度为1.0 μg/mL的混合标准中间溶液（环丙沙星、沙拉沙星浓度约1.5 μg/mL），于4℃以下避光保存，临用新配。
3.22 内标标准储备液配制：分别称取氘代同位素标准品（3.18）约10 mg，至10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3），超声溶解，用乙腈（3.1）稀释至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，于-18℃以下避光保存，有效期6个月。
3.23 混合内标标准中间溶液的配制：准确吸取内标标准储备液（3.22）0.01mL于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成浓度为1.0 μg/mL的混合内标标准中间溶液，于4℃以下避光保存，临用新配。
3.24 固相萃取小柱（500 mg，6 mL）：HLB柱或相当者。使用前依次以6 mL甲醇、6mL水活化，保持柱体湿润。 4 仪器和设备
4.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
4.2 分析天平：感量0.001g和0.00001 g。 4.3 涡旋振荡器 4.4超声仪
4.5离心机：转速≥8000 r/min 4.6 均质器 4.7 氮气浓缩仪 5 测定步骤 5.1 试样制备与保存
豆制品、火锅和麻辣烫的食材
从待检样品中取出样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃冷冻存放。
火锅底料、麻辣烫底料
固体状：从待检样品中取出样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于4℃冷藏存放。
半固体状：从待检样品中取出样品约500g，放入研钵中，迅速研磨均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记于4℃冷藏存放。
液体状：从待检样品中取出样品约500g，搅拌均匀后装入洁净容器中，密封，并标明标记，于4℃冷藏存放。 5.2 样品溶液制备
提取：称取5.0 g均匀样品（精确至0.001g），置50 mL离心管中，精密加入混合内标标准中间溶液（3.23）0.1mL，加入20 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（3.15），涡旋混匀1min，超声提取15 min，8000 r/min离心5 min，上清液转移至50 mL容量瓶中，残渣用EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（3.15）同法重复提取两次，每次10 mL，合并上清液至同一容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（3.15）定容至刻度，混匀。用滤纸过滤（必要时10000 r/min离心5 min后过滤），续滤液待净化。
净化：精密吸取上述待净化液25.0 mL，以约1 mL/min的流速全部通过固相小柱（3.24），用3 mL 5%甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6 mL甲醇、3 mL氨水甲醇（3.17）洗脱，合并甲醇及氨水甲醇洗脱液，45 ℃氮吹至近干，准确加入2.0 mL流动相初始比例复溶液溶解残渣，过0.22 μm滤膜，续滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
5.3 基质标准工作溶液的制备
称取5.0 g空白试样（精确至0.001g），置50 mL离心管中，除不加入混合内标标准中间溶液外，其余同5.2操作处理后得到空白基质，共制备6份。
分别精密吸取混合标准中间溶液（3.21）0 mL、0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL及混合内标标准中间溶液（3.23）0.025 mL于试管中，氮吹至近干，精密加入1.0 mL空白基质复溶，过0.22 μm滤膜，制成浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的基质标准工作溶液（环丙沙星、沙拉沙星浓度为0 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、75 ng/mL、150 ng/mL、300 ng/mL，同位素内标浓度约25ng/mL）。 5.4 测定
5.4.1 液相色谱参考条件
1） 色谱柱：C18色谱柱，2.1 mm×50 mm×1.7 μm，或性能相当者。 2） 柱温：40℃。 3） 流速：0.25 mL/min。 4） 进样量：2 μL。
5） 流动相：A-5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），B-乙腈。梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件
时间（min）
0 3 8 10 10.5 13 13.1 15
A(%) 90 90 70 70 5 5 90 90
B(%) 10 10 30 30 95 95 10 10
5.4.2 质谱参考条件
1） 电离方式：电喷雾电离（ESI）； 2） 扫描方式：正离子扫描； 3） 检测方式：多反应监测MRM； 4） 离子源参数参考条件：
离子源接口电压， 4000 V；离子源接口温度，350 ℃；脱溶剂温度，250 ℃；离子源加热温度， 400 ℃；雾化气流速，2.9 L/min；干燥气流速，10.0 L/min；加热气流速，10.0 L/min。
5）定性离子对、定量离子对参见表2。
表2 喹诺酮类药物主要质谱参数
序号
组分
母离子 （m/z）
1
诺氟沙星
320.2
子离子 （m/z） *302.0 231.1 *318.2 261.1
3
洛美沙星
352.0
*265.0 308.0 290.1 *316.2 *326.0 269.0 342.0
6
沙拉沙星
386.2
299.1 *368.1
7
双氟沙星
400.0
*356.0 299.0
8
司帕沙星
393.0
*349.0 292.0 *314.1
9
环丙沙星
332.1
287.8 231.0 *340.1
10
达氟沙星
358.0
283.2 82.1 *342.1
11
恩诺沙星
360.0
316.0 245.2
12 13 14
D8-环丙沙星 D5-恩诺沙星 D5-诺氟沙星
340.3 365.1 325.3
322.1 321.1 307.2
Q1 预四极杆电压 （V）
-16 -15 -30 -30 -25 -25 -25 -25 -30 -29 -15 -29 -14 -17 -17 -30 -30 -25 -24 -25 -26 -14 -26 -27 -13 -28 -10 -11 -10
碰撞电压 (V) -21 -39 -18 -28 -23 -17 -18 -21 -20 -28 -19 -30 -22 -20 -28 -21 -21 -21 -17 -40 -23 -24 -44 -20 -20 -27 -21 -19 -20
Q3 预四极杆电压
（eV） -21 -25 -24 -19 -29 -22 -20 -22 -23 -26 -25 -20 -26 -25 -28 -28 -24 -22 -30 -40 -24 -30 -15 -25 -22 -17 -22 -22 -21
2 氧氟沙星 362.2
4 培氟沙星 334.0
5 氟罗沙星 370.0
注：1.“*”表示定量离子；2. 所列质谱参考条件是在岛津（LC/MS-8050）质谱仪上完成的，此处所列试验用仪器型号仅供参考，不涉及商业目的，鼓励方法使用者尝试不同厂家或型号的仪器；3. 对不同质谱仪，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳；4. 由于喹诺酮类化合物离子化受基质干扰较为显著，方法使用者可根据实际情况选择表中所列离子对进行定性定量测定。
豆腐、豆干、火锅底料、麻辣烫底料及火锅食材中添加喹诺酮
