斜面接种大肠杆菌的主要目的有菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。具体操作步骤： 准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→培养大肠杆菌→保存菌种 3.平板划线分离和培养大肠杆菌
在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。 (1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作
加棉塞
配制好的培养基装瓶――→灭菌→倒平板操作(A.打开瓶塞→B.灼烧瓶口灭菌→C.倒培养基→D.倒置平板)。
(2)平板划线分离与培养大肠杆菌
①平板划线法的含义：用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。
②注意事项：接种和划线操作时需要在酒精灯火焰附近进行。
1.利用培养基培养微生物时，首先要把微生物接种到培养基上。以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例，完成下列有关问题：
(1)以下为细菌培养基的配制的流程，若将分装步骤与调节pH步骤颠倒过来是否可行？ 配制培养基→调节pH，数值为7.2→分装→包扎→灭菌，常用方法为高压蒸汽灭菌 →搁置斜面，需冷却至50 ℃左右
答案 不行。若分装后再调节pH，会使培养基中pH调节不均匀；还可能将培养基弄到试管口，易被污染。
(2)从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。 2.斜面接种和培养大肠杆菌 (1)下图接种方法分别是什么？
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答案 图1是穿刺接种、图2是斜面接种、图3是平板划线接种。 (2)下表是关于接种操作步骤及其目的或分析说明，请完善下表。
顺序 ① ② ③ 接种操作步骤 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红 在火焰旁冷却接种环，拔去试管棉塞 将试管口通过火焰 将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触斜面顶端 抽出接种环时，带菌部分不要触及管壁或通过火焰 在培养基斜面上由底部向上轻轻划“S”型曲线，但不要将培养基表面划破 将试管口与试管塞通过火焰2～3次，迅速塞紧试管 将接过种的试管，放在恒温箱(37 ℃)中培养24_h 分析说明或目的 将接种环灭菌，避免污染菌种 避免杂菌污染菌种 灼烧灭菌，防止试管口菌体污染培养基 使接种环冷却，避免杀死菌种 防止菌种沾于管壁，防止菌种被杀死 初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准 防止杂菌污染 培养细菌，观察接种和培养的结果 ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
3.平板划线分离和培养大肠杆菌
在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。思考回答下列相关问题： (1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
答案 ①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。③接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。④划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。
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(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。
(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，是为了保证菌落是由单一的细菌繁殖而成。 (4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。 (6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？
答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，达不到纯化的效果。
3.关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，不正确的是( ) A.配制固体培养基时一般要加适量的琼脂
B.分装到试管中的液体培养基的高度约为试管高度的1/2 C.待培养基冷却至50 ℃左右时进行搁置斜面 D.搁置斜面时，斜面长度不超过试管总长的1/2 答案 B
解析 在配制固体培养基时，琼脂是最常用的凝固剂，A正确；分装到试管中的液体培养基的高度约为试管长度的1/5，B错误；待培养基冷却至50 ℃左右时进行搁置斜面，以防培养基因温度过高而烫手，也不能过低，防止凝固后不易倒平板，C正确；搁置斜面时，将试管口部枕在高约1 cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然倾斜，斜面长度不超过试管总长的1/2，D正确。
4.在接种操作的过程中，不正确的是( ) A.要将接种环灼烧灭菌
B.取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌
C.将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 D.接种后还要将管口灭菌加塞
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答案 C
解析 接种环伸入试管内后先接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位，待接种环冷却后再接触长菌部位。
5.下图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是( )
A.操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌 B.划线操作须在火焰上进行 C.在5区域中才可以得到所需菌落
D.在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌 答案 D
解析 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作在火焰边进行；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。 一题多变
(1)平板划线法所用培养基属于什么培养基？ 答案 琼脂固体培养基。
(2)如何确认制备的培养基是否合格？
答案 将一个未接种的培养基同接种培养基一起培养，若未接种的培养基无菌落生长，说明制备的培养基合格，否则需要重新制备。
(3)如果培养基上长出的菌落相互重叠，则说明存在什么问题？ 答案 说明划线不充分，应该重新操作。
(4)在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于哪里？ 答案 接种环上的菌种直接来源于上次(第一区中)划线的末端。
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1.下图是灭菌锅及其局部剖面示意图，其中甲、乙、丙依次指( )
A.安全阀、排气阀、压力表 B.排气阀、安全阀、压力表 C.安全阀、排气阀、温度表 D.排气阀、安全阀、温度表 答案 A
解析 根据教材P8图Ⅰ－Ⅰ高压蒸汽灭菌锅结构示意图，可判断甲、乙、丙分别为安全阀、排气阀、压力表。
2.在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确的顺序为( ) ①溶化 ②调pH ③加棉塞 ④包扎 ⑤分装 ⑥称量 A.①②⑥⑤③④ C.⑥①②⑤④③ 答案 B
解析 上述步骤中，培养基的配制顺序为称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→包扎。 3.下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是( )
A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 B.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种 C.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D.划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 答案 C
解析 平板划线操作中，接种环挑取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物，以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种。划线结束仍需灼烧接种环，是为了能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。
B.⑥①②⑤③④ D.①②⑤④⑥③
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2017-2018学年高中生物 第一章 无菌操作技术实践 第1课时 微生物的分离和培养同步备课教学案
