如有你有帮助，请购买下载，谢谢！
注射用重组人促红素（CHO细胞）
Zhusheyong Chongzu Ren Cuhongsu (CHO Xibao) Recombinant Human Erythropoietin for Injection (CHO
Cell)
本品系由高效表达人红细胞生成素（简称人促红素）基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造
2．1工程细胞
2．1．1名称及来源
重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系。
2．1．2细胞库建立、传代及保存
由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。每次传代不超过批准的代次。细胞系冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。
2．1．3主细胞库及工作细胞库细胞的检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2．1．3．1外源因子检查 细菌和真菌（附录XIIA）、支原体（附录XIIB）、 病毒检查（附录XIIC）均应为阴性。 2．1．3．2细胞鉴别试验
应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。
2．1．3．3人促红素表达量
应不低于原始细胞库细胞表达量。
目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。 2．2原液
2．2．1细胞的复苏与扩增
从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定（附录ⅫI D）。
2．2．2细胞培养液
生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。 2．2．3细胞培养
细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。 2．2．4分离纯化
收集的培养液采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，即为人促红素原液。除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
2．2．5原液检定 按3.1项进行。
1页
如有你有帮助，请购买下载，谢谢！
2.3半成品
原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。 按3.2项进行。 2.4成品
应符合“生物制品分批规程”规定。
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。半成品应及时分装、冷冻。冻干的全过程中，制品温度应不高于30℃。
应为经批准的规格。
应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定
3.1原液检定
用4g/L碳酸氢铵溶液 将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，340nm，345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法（附录II A），在波长276nm～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长带入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散射。按下式计算，应不低于0.5 mg/ml。
蛋白质含量（g/100ml）=（Amax-A光散射）÷7.43×供试品稀释倍数 依法测定（附录Ⅹ B）。
按酶联免疫法试剂盒说明书测定。 每1mg蛋白质应不低于1.0×105IU。 体外比活性 每1mg蛋白质应不低于9.0×104IU。 依法测定（附录Ⅳ C）。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。
依法测定（附录Ⅲ B）。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300 kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠1.5mmol/L磷酸二氢钾400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量20～100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。 按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。
依法测定（附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36～45kD。
依法测定（附录Ⅱ A），用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml,在光路1cm、波长230nm-360nm下进行扫描，最大吸收峰279nm±2nm；最小吸收峰250nm±2nm；在320～360nm处无吸收峰。
使用含有pH范围为3至5的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶。取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40% pH 3至5的两性电解质溶液1.05ml、40% pH 3至10的两性电解质溶液0.45 ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N’N’N’N’-四甲基乙二胺 15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl（浓度应在每1 ml含0.5 mg以上），照等电聚焦电泳法进行（附录Ⅳ D），同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。
每1mol人促红素应不低于10.0mol(附录Ⅵ C)。 每10000IU人促红素应不高于100pg（附录Ⅸ B）。 CHO细胞蛋白残留量
用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于0.05%。
每10000IU人促红素应小于2EU（附录 Ⅻ E凝胶限量试验）。 用酶联免疫法检测，应不高于0.01%。
2页
如有你有帮助，请购买下载，谢谢！
供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定（附录Ⅷ E），其中加入胰蛋白酶(序列分析纯)，37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm) ，柱温为45℃±0.5℃；流速为每分钟0.75ml；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液）。
编号 时间/分钟 流速/ml A% B% 1 0. 00 0.75 100.0 0.0 2 30.00 0.75 85.0 15.0 3 75.00 0.75 65.0 35.0 4 115.00 0.75 15.0 85.0 5 120.00 0.75 0.0 100.0 6 125.00 0.75 100.0 0.0 7 145.00 0.75 100.0 0.0 肽图应与人促红素对照品一致。
N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次)
用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为：
Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。 3.2半成品检定
依法测定,每1000IU人促红素应小于2EU（附录Ⅻ E凝胶限量试验）。 依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。 3.3成品检定
除复溶时间和水分测定外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。 按免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录Ⅷ B）测定，应为阳性。 应为白色疏松体，复溶后为无色澄明液体。
加入标示量的灭菌注射用水，复溶时间应不超过2分钟。 依法检查（附录Ⅴ B），应符合规定。
按附录Ⅰ A中装量差异项进行，应符合规定。 应不高于3.0%（附录Ⅶ D）。 pH值
依法测定（附录Ⅴ A ），应符合批准的要求。。 钠离子含量
应不大于190mmol/L（附录Ⅶ J）。
如制品中加入枸橼酸钠，则枸橼酸离子应不大于25mmol/L（附录Ⅶ H第二法）。 依法测定（附录Ⅵ B第二法），应符合经批准的蛋白质含量范围。 渗透压摩尔浓度
依法测定（附录V H），应符合批准的要求。
按酶联免疫法试剂盒说明书测定供试品体外活性（IU/ml），根据标示装量计算供试品生物学活性（IU/瓶），应为标示量的80%～120%。
按附录Ⅹ B测定供试品体内活性（IU/ml），根据标示装量计算供试品生物学活性（IU/瓶），应为标示量的80%～140%。
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
每1000IU人促红素应小于2EU； 5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于10EU每1次人用剂量应小于10EU/ml（附录Ⅻ E凝胶限量试验）。
依法检查（附录Ⅻ F小鼠试验法），应符合规定。
3页
注射用重组人促红素(CHO细胞)
