方案一
实验方法：一步法共价结合
实验步骤：
1、配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；
2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L；
3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；
4、将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合，混合后在温室培育20分钟；
5、用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10mg/mL（52μmol/mL）；
6、取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中；
7、用0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH值至6.5±0.2，在摇床温室培育2小时；
8、将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。
方案二
实验方法：简单二步法共价结合
实验步骤：
1、配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；
2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L；
3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；
4、1mL胶乳微球悬浮液，加入20mgEDAC，在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20mg/mL；
5、用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理；
6、将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/mL；
7、再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3小时；
8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；
9、除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中
方案三
实验方法：生成NHS-酯的中间体二步法共价结合
实验步骤：
1、每ml反应混合物加入下列各物： a． 去离子水是最后容积为1.0mL；
b．0.1mL的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5M MES缓冲溶液）；胶乳微球最终浓度为1%（W/V）； c． 0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液； d．19.2mg/mL（100mM）的EDAC在去离子水中的溶液
2、在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3、用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC；
4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；
5、将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中，浓度为1mg/mL；
6、立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%（w/v）、0.5mg/mL、25-50mM）；
7、将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌；
8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；
9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液中。
附录
试剂：
MES缓冲液
500mM 和 50mM；PH6.1；4°C 储存（如果发黄或者污染，应倒掉） 。
EDAC
盐酸 1－乙基－3－二甲基氨基丙基二酰亚胺 ；52umol/ml：分析天平称取 10mg EDAC，加入 1ml 去离子水。 （EDAC 对潮气非常敏感，在水中快速水解，EDAC 储存于干燥器中，-5 °C 保存。 ） NHS
N－羟基琥珀酰亚胺 ；50mg/ml 水溶液
蛋白质溶液
蛋白质充分稀释溶解，浓度为 1－10mg/ml
技术说明 ：
1．微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变；
单位质量的微球表面积（m2/g） ： A/M = 6/PD 其中 D= 微球粒径（μm）
P = 微球密度 (聚苯乙烯 1.05g/ml)
例如：0.8μm的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.05×0.8 = 7.14 m2/g
1.6μm 的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.05×1.6 = 3.57 m2/g
0.8μL ，10mg 聚苯乙烯微球需加入 125－250μL 多克隆抗体 1.6μL ，10mg 聚苯乙烯微球需加入 62.5－125μL 多克隆抗体
2．虽然疏水性吸附与缓冲液 pH值无关，但反应缓冲液的 pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点 pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用；
3．高效搅拌下，将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液，可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度；
4．绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。
方案五
Sample Protocol for Two-Step Carbodiimide Coupling of Protein to Carboxylated Microspheres
Microspheres should be protected from prolonged exposure to light throughout this procedure.
1.Resuspend the stock uncoupled microspheres according to the instructions described in the Product Information Sheet provided with your microspheres.
2.Transfer 5.0 x 106 of the stock microspheres to a USA Scientific microcentrifuge tube.
3.Pellet the stock microspheres by microcentrifugation at ≥ 8000 x g for 1-2 minutes.
4.Remove the supernatant and resuspend the pelleted microspheres in 100 μL dH2O by vortex and sonication for approximately 20 seconds.
5.Pellet the microspheres by microcentrifugation at ≥ 8000 x g for 1-2 minutes.
6.Remove the supernatant and resuspend the washed
microspheres in 80 μL 100 mM Monobasic Sodium Phosphate, pH 6.2 by vortex and sonication for approximately 20 seconds.
7.Add 10 μL of 50 mg/mL Sulfo-NHS (diluted in dH20) to the microspheres and mix gently by vortex.
1、胶乳偶联方案的输出
