基因工程原理 - 图文

图3-6 平末端与黏性末端(Hartl,1991)

Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。粘性末端是指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生的三种不同类型的末端(表3-3)。 表 3-3 某些限制性内切酶及产生的末端 5'-粘性末端 酶 Taq I

T/CGA

3'粘性末端 Pst I CTGCA/G

平末端

识别序列 AG/CT CG/CG GA/TC GG/CC CAG/CTG CCC/GGC GCC/GGC GTT/AAC TCG/CGA TGG/CCA TGC/GCA TTT/AAA GAT/ATC

识别序列 酶

识别序列 酶

Alu I FnuDⅡ Dpn I Hae Ⅲ Pvu Ⅱ Sma I Nae I Hpa I Nru I Bal I Mst I Mha Ⅲ EcoRⅤ

Cla I AT/CGAT Mbo I /GATC BglⅡ A/GATCT BamHI G/GATCC Bcl I T/GATCA HindⅢ A/AGCTT Nco I C/CATGG Xma I C/CCGGG Xho I C/TCGAG EcoR I G/AATTC Sal I G/TCGAC Xba I T/CTAGA

Sac I GAGCT/C Sph I GCATG/C Bde I GGCGC/C Apa I GGGCC/C Kpn I GGTAC/C

基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其他一些工具酶包括连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。其中最重要的是连接酶。

第三节 基因工程载体

载体(vector, vehicle) 的本意就是媒介体，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，称为克隆载体。基因工程中有三种主要类型的载体∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体DNA的结合体，运载能力最高(图3-7)。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。

图3-7 三种类型的载体(引自Greene,1998 )

一、质粒载体

质粒(plasmid)是染色体以外的遗传物质，它是双链闭合环状DNA分子，其大小可从1kb到200kb左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制。质粒是基因工程的主要载体。 (一)质粒概念

1946—1947年间，Lederberg和Tatum发现了细菌的接合现象，这是细菌的有性繁殖方式。 此后不久，便弄清了这种接合是两种不同的交配型(接合型)，遗传信息总是从供体(雄性)转移到 受体(雌性)。当两种不同的交配型的细菌相互识别和接合以后，雄性细胞的致育因子，通过细胞的表面结构传递到雌性细胞，这种致育因子后来称为F因子。 1952年，Lederberg指出，细菌的F因子与高等生物细胞质中染色体外的遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体的遗传单元。

一般来讲，质粒是细胞中能够独立复制的复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒对细胞的生存没有影响，但质粒DNA上也有一些编码基因，赋予宿主细胞一些特性。 自发现能赋予细菌性别特征的F因子以后，又在大肠杆菌中发现了一种能够编码抗菌物质——大肠杆菌素的Col质粒，包括ColB，ColV，ColE等。由这些因子产生的抗菌物质称细菌素(bacleriocin)，是细菌所合成的一种蛋白质，对于同种或近缘种具有毒性。合成细菌素的能力和对于细菌素的抗性，都由染色体外的遗传因子所控制。

在1959一1960年间，日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时，发现病原菌志贺氏 菌含有使其同时能抗几种抗生素的基因，而且，这种抗药性基因能以和F因子非常相似的方式 转移给其他肠道细菌，这就是抗药因子(R因子)。抗药因子(resistance factor)实际上是控制细菌抗药性的一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两部分组成。每个抗药因子上常具有几个抗药性基因。

（二）质粒DNA的基本性质

大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子。如果两条链都是完整的环，这种质粒DNA分子称为共价闭合环状

DNA(covalently closed circular, CCC DNA)。CCC DNA有两种构型，超螺旋DNA( supercolied DNA，SC DNA)和松弛的DNA(Relaxed DNA),分别是由DNA促旋酶(DNA gyrase) 和拓朴异构酶(topoisomerase)作用的结果。如果质

粒DNA中有一条链是不完整的，那么这种DNA分子就称为开环的(open circles,OC DNA)，开环的DNA通常是由内切酶或机械剪切造成的图3-8)。从细胞中分离质粒DNA时，质粒DNA常常会转变成超螺旋的构型。

图3-8 质粒DNA的三种构型(引自Old & Primrose,1980) 溴化乙啶(ethidium bromide，EtBr)是一种扁平的分子，能够插入到DNA分子的碱基对之间，引起双螺旋的部分解旋，从而改变了DNA的体积和密度。

图3-9 相对分子质量相同构型 不同的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 （引自 Old & Primrose, 1980） 由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，CCC DNA的泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中(图3-9)，所以很容易通过凝胶电泳和EB染色的方法将不同构型的DNA分别开来。

（三） 质粒分类

根据质粒的拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同,

松弛型质粒(relaxed plasmid)的复制只受本身的遗传结构的控制，

而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数。通常可达10—15个/每染色体。并且可以在氯霉素作用下进行扩增，有的质粒扩增后，可达到3000/每染色体(ColE1, 可由24个达到1000至3000个)。这类质粒多半是分子量较小, 不具传递能力的质粒。基因工程中使用的多是松弛型质粒。

严紧型质粒(stringent plasmid)在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有1—2个/每染色体。这种质粒一般不能用氯霉素进行扩增。 严紧型质粒多数是具有自我传递能力的大质粒。质粒的复制特性是受复制子控制的。 基因工程中使用的质粒多数是松弛性质粒载体。 （四）载体的条件

就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分(图3-10)∶复制区，含有复制起点；选择标记，主要是抗性基因；克隆位点，便于外源DNA的插入。

就复制特性来讲，要求载体必需有独立的复制起点, 最好是松弛型复制，这样便于得到大量的拷贝。有时需要有多个复制起点，能够在不同的宿主细胞中复制，扩大宿主范围。

具有合适的克隆位点, 便于外源DNA的插入。克隆位点实际上限制性酶切位点，最好是具有多种限制性内切酶的单切点，这样适应性强，克隆方便，如果一种酶在载体上有多个切点，就会限制该切点的使用。

具有可检测的选择标记, 也是一个重要的基本条件，这种选择标记最好是能够赋予宿主易于检测的表型。选择标记就是常说的报告基因(report genes)，包括抗生素抗性标记，以及一些生化表型的标记。

另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量，因为小分子的质粒DNA易于操作，不容易被损伤，也容易被分离纯化。一般说小分子量的质粒分子的拷贝数比较高，酶切位点也少。

图3-10 质粒载体的基本结构 二、杂合载体

除了质粒载体外，噬菌体的DNA也可作为载体，不过都是改造过的，自然病毒的DNA不能作为载体。目前在基因工程中使用的载体大多是质粒和噬菌体的杂合载体。 （一）柯斯质粒(cosmid)载体

cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的缩写, 本意是带有粘性末端位点的质粒, 因此, 柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记, 加上λ的cos位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆(图3-11)。

图3-11 柯斯质粒载体克隆(引自Lodish et al,1986)

早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，后来进行了一些改进，克服了这些不足。

柯斯质粒具有如下特点:

1. 具有质粒复制子。目前构建的柯斯

质粒大多具有pMB1复制子或ColE1复制子, 所以进入寄主细胞后能够象质粒一样进行复制, 并且能够被氯霉素扩增。

2. 具有质粒载体的抗生素抗性基因

的选择标记。如果在这些标记中有

克隆位点的话可用插入失活法进行筛选。例如上面构建的MuA-3就具有四环素抗性基因。

3. 具有λ噬菌体的包装和转导特性。由于柯斯质粒具有λDNA的cos位点和相应的包装序列, 因此在克隆了

适当大小的外源DNA以后可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒, 并能进行转染。转导的能力比纯的质粒大3个数量级。进入寄主细胞后, 又可以自我环化。但它不能同寄主的染色体DNA整合, 也不会产生子代噬菌体裂解寄主。

4. 溶载能力大。这是柯斯质粒的最大优点。被克隆的DNA大小具有上限和下限, 这是因为柯斯质粒最后是被

包装到噬菌体颗粒, 它的最后大小应在噬菌体基因组的75%-105%之间。由于载体分子一般在5kb左右, 所以克隆的最大片段在45kb;如果载体的分子量为15kb的话, 克隆的最小片段为19kb。因此柯斯质粒适合构建真核生物的基因库, 而不适合克隆原核生物的基因。

（二）pUC载体系列的构建

美国加州大学的Vieira和Messing利用pBR322和M13载体的优点，构建了一个更小的载体，称为 pUC7（图3-12），并在此基础上发展了pUC载体系列。

图3-12 pUC载体的构建(引自Winnacker,1987)

pUC载体具有很多优点∶①多克隆位点；②松弛复制；③有氨苄青酶素抗性；④可通过化学显色筛选。

现在最常用的pUC载体是pUC18(图3-13),它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增。