间接ELISA法效价检测抗血清效价
通过间接ELISA法来确定抗原最佳包被浓度 (方阵滴定,也叫棋盘滴定法) 。 以兔高免血清多抗效价检测为例
1. 抗原用包被缓冲液CBS (0.05M碳酸盐缓冲液,pH9.6)按1μg/ml浓度用作连续1:2倍比稀释,每个稀释度包被一行(12孔/行),100μl/孔加入酶标板中,覆膜密封(防止水分挥发)4℃包被过夜(12h以上)。
2. 次日甩掉板中液体,在吸水纸上拍干板子,每孔加入150μl封闭液(含2% BSA的包被缓冲液CBS),室温(25℃) 2h以上。 3. 用洗涤液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次,此时将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液(含1% BSA的PBS缓冲液,pH7.4)分别从1:500开始做连续1:2倍比稀释,按下图分布模式100μl/孔,37℃ 1h。
4. 取出拍干,洗涤液洗板3次,每孔加入100μl二抗工作液(用抗体稀释液1:3000稀释HRP标记羊抗兔IgG,Frdbio,Cat No.:SAB90200H),37℃孵育1h。
5. 取出拍干,洗涤液洗板3次,每孔加入100μl单组份TMB底物(Frdbio,Cat No.:ELS0010),室温孵育5~20min(根据颜色的改变速度)。
6. 每孔加入50μl终止液(0.5M H2SO4)。 7. 在酶标仪上读取450nm/630nm的吸光度。
标准的结果分布模式应该如上图所示: ELISA酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减;如果在包被梯度方向上OD450过高无梯度,应该继续降低包被浓度;反之,则增加。同理,如果在免疫血清稀释度方向上OD450过高无梯度,则应继续加大稀释度,反之,则减小。 8. 最佳包被浓度的确定:
阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/其左孔OD值恰好为2倍关系且OD值不低于1.2,且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异,此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。同理也可以参照此方法确定阳性血清的最佳稀释倍数。
如果方阵滴定的数值结果不能如图分布,则需要重新设计方阵实验。
9. 以最佳包被浓度将抗原按照上述方法包被到酶标板同时封闭,将阴性/阳性血清依次倍比稀释,100μl加到酶标板孔(最好做复孔),然后依次加入二抗、底物显色,读取OD值。
对应稀释度阴性血清OD值的2.1倍确定为阳性值,也称Cut-off值,这个是检验学上的常用方法,而往往制备抗体的高免血清的稀释度都比较高,其对应稀释度的阴性血清值接近于空白值,所以这个判断方法作为ELISA稀释终点没有意义,Frdbio定义ELISA终点方法为:OD值-空白值或阴性对照值≧0.100(前提条件是空白孔值/阴性对照孔OD值﹤0.050),可以根据自己的实验室具体情况自己确定合适的终点判定标准。 货号 ELS0001 ELS0203 ELS0030 IMR0201 产品名称 高吸附酶标板 酶标板稳定剂 Efficent Coating Plate 抗体稀释液 包装/规格 10plates 10plates 10 plates 100ml 产品描述 蛋白吸附量大,背景低。 稳定抗原包被后的酶标板,稳定期长达2年,检测值下降不超过15%。 供价包被不易脱落,包被环境中性,不损伤蛋白,蛋白用量少。 最大提高抗原抗体结合,同时降低非特异性结合背景问题。 IMR0202 ELS0010 IMR0101 HRP酶标抗体稀释液 Frdbio○R单组份TMB Frdbio免疫检测信号增强剂 100ml 100ml/500ml 100ml/500ml 最大提高抗原抗体结合,提高酶活性,降低非特异性酶底反应。 即用型TMB底物,直接使用,灵敏度稳定性优于进口Sigma T0440 增强抗原与抗体的结合,最高可以提高信号10倍,适用于ELISA和Western Blot。