仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产操作细则本品系使用免疫原
性良好的猪霍乱沙门氏菌弱毒株，接种适宜培养基培养，收获培养物加入适当稳定剂，经真空冷冻干燥制成。本品用于预防仔猪副伤寒活疫苗。
、菌种11.1疫苗生产用菌种为猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株，原种购于中国兽药检查所，经扩繁后由质检部鉴定、保管、供应。 1.2菌种标准
1.2.1 C500弱毒株应符合以下标准
1.2.1.1 形态和生化特性 本菌为革兰氏阴性小杆菌，生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。
1.2.1.2 培养特性 在普通琼脂平板上，37℃培养18-22小时，菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型。
1.2.1.3 血清学特性 普通琼脂新鲜培养物用玻片凝集检查法，对沙门氏菌属O7因子血清出现凝集反应。
1.2.1.4 特异性 在含1%的醋酸铊的普通肉汤中呈均匀浑浊生长，用新鲜普通琼脂培养物与0.2%吖啶黄溶液做玻片凝集试验应不出现凝集反应。
1.2.1.5 安全性 用pH7.4-7.6的普通肉汤或蛋白胨水，将培养24-48小时的普通琼脂斜面培养物洗下并作活菌计数，注射下列动 物应符合标准。．
小白鼠 18-22g（30-35日龄）的小白鼠10只，各皮下注射0.2ml，
含活菌数1亿，观察21日，至少应存活9只。
家兔 体重1.5-2.0kg的家兔5只，各皮下注射1ml，含活菌数100亿，观察21日应存活。
仔猪 用体重15kg以上的健康易感断奶仔猪4头，各静脉注射1ml，含活菌数30亿，观察1个月应存活。
年。℃保存期为101.3 冻干菌种2-8 2、疫苗制造及半成品检验 生产用菌种的制备2.1
2.1.1 一级种子繁殖和鉴定 冻干种子用普通肉汤稀释或经普通肉汤后，接种普通琼脂平板，37℃培养18-20小时，观察菌落形态，菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型。选取中等偏大的菌落5-10个，混合后接种于普通琼脂斜面若干只，37℃培养24小时，经纯粹检验合格，并用0.2%吖啶黄溶液做玻片凝集试验应合格，作为一级种子。在2-8℃保存期不超过1个月，在此期间可以移植1-2次，在培养基上继代不超过5代。
2.1.2 二级种子繁殖 取一级种子接种于普通琼脂或普通肉汤，37℃培养24小时，经纯粹检验合格后，即可作为生产种子，在2-8℃保存期不超过2日。 2.2 制苗用培养基制备 2.2.1 材料要求
岁，前后腿、胸部，尽量3-5要求应采购新鲜的精牛肉， 牛肉． 少含脂肪、肌腱、筋膜等。 1.5% 鱼蛋白胨
0.5%胰蛋白胨 0.5% 氯化钠 氢氧化钠 水
2.2.2制备方法 将新鲜的精牛肉去掉脂肪、筋膜等绞碎，纯化水低温浸泡24小时，100℃煮沸2小时，补足失去的水分，冷却静止沉淀24小时，抽取上清液，加入鱼蛋白胨、胰蛋白胨、氯化钠溶化，用氢氧化钠溶液调整pH值至7.8，煮沸20分钟，降温静止沉淀。 3、制苗用菌液制备
条件准备3.13.1.1 根据菌液制备所需物品及设备条件，进行全面准
备。
3.1.2 按使用时间，提前做好对发酵罐空消工作，包括罐体、空气过滤系统、各个进出料口，确保灭菌无死角。将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。
3.1.3在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。
3.1.4提前一天对发酵罐进行全面灭菌，并保持发酵罐正压。 3.2 进料及培养基灭菌
将配制好的培养基通过管道打入发酵罐和猪油（消泡剂），然后对进料管道进行清洗、灭菌，关闭进料阀门，对培养基及所有的进出口、空气过滤系统进行灭菌，当温度达到90℃和100℃时，分别经上面空气进管和下面放料口向罐内通入蒸汽1分钟左右，罐内116℃保持40分钟，其他位置121℃保持40分钟。灭菌结束后马上夹层通冷水进
行降温并及时补充无菌空气保持罐内正压。当温度降至40℃时，关闭冷水管道停止降温，通无菌空气保持罐内正压，打开自动控温系统的阀门和开关，温度控制在37℃。
3.3 接种在火焰保护下，连接种子瓶和发酵罐接种口，打开发酵罐出气阀关小发酵罐进气阀使罐内压力接近于0，确认无误后打开接种阀门，利用正压空气将二级种子按1%-2%的接种量接种于普通肉汤中，然后按2.5%加入40%灭菌葡萄糖溶液。 发酵培养3.4
接种后先小气量通入无菌空气2h，然后逐渐加大通气量，每2h增加通气量，培养后期每小时测定一次pH，当pH上升到7.8时加入40%葡萄糖溶液2000ml调整pH，培养18～20小时，当菌数将要达到最高峰时停止培养收获菌液，将菌液放入灭菌大玻璃瓶中。 4、配苗
将事先准备好的冻干保护剂加入收苗瓶中摇匀，保护剂和菌液的。5%和1.3%明胶和蔗糖的最终含量分别是，1:7比例是
配苗完成后马上进行分装和冻干。 注意事项：
1、培养基是菌苗生产的关键，一定要把握好原材料的质量。 2、发酵罐灭菌时，应注意千万不要留有死角，通气管道压力应高于罐内压力，不要造成培养基倒吸入空气过滤器。
3、通气培养时应认真仔细，10小时后每小时要测定pH值，根据pH
值的变化加入适量的葡萄糖溶液。
4、注意无菌操作，生产种子应进行纯粹检验，接种、补料应尽量采用管道连接而不采用开口方式进行操作,避免污染事故的发生。
仔猪副伤寒活疫苗
