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PCR扩增
一、聚合酶链式反响〔PCR〕的定义
PCR是聚合酶链式反响的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板〔克隆或基因组DNA〕的扩增反响，是模拟体DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 二、聚合酶链式反响〔PCR〕的根本原理
是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进展互补链的延伸，屡次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，参加与待扩增的DNA片段两端序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP
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溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg等。反响时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成局部双链，称为退火；再将温度升至适宜温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反响的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三局部构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
1．模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时，一般是94℃，双螺旋构造的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反响作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级构造的复杂性、G-C含量上下等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜〔DMSO〕，并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
2．模板DNA与引物的退火
将反响混合物温度降低至40~60℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。
退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，且模板DNA比引物复杂得多，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择适宜的温度：
Tm值〔解链温度〕=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许围，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反响的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 3．引物的延伸
DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。
PCR反响的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反响的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以的DNA片段，
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延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4.重复循环
重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链〞，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸〞循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。
PCR的三个反响步骤反复进展，使DNA扩增量呈指数上升。反响最终的DNA扩增量可用Y＝〔1＋X〕n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平〔Y〕均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反响中平均效率达不到理论值。反响初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应〞，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可防止的。
三、聚合酶链式反响〔PCR〕的扩增产物
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两局部。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反响周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开场延伸，其5'端是固定的，3'端那么没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段〞。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链〔即“长产物片段〞〕结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以、形成长短一致的“短产物片段〞。不难看出“短产物片段〞是按指数倍数增加，而“长产物片段〞那么以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反响产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 四、PCR反响的五个元素
参与PCR反响的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液〔其中需要Mg2+〕。 1.引物 〔1〕．引物的定义
引物是PCR特异性反响的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
〔2〕．引物设计的原那么
引物设计有3条根本原那么：首先引物与模板的序列要严密互补，其次引物与引物之间防止形成稳定的二聚体或发夹构造，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反响〔即错配〕。 引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以防止背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：假设使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反响指数期的产量理论值。当然，即使有
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了好的引物，依然需要进展反响条件的优化，比方调整Mg浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规那么确保PCR的成功，但遵循某些
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原那么，那么有助于引物的设计。
〔1〕引物长度 PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp〔20bp〕，但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反响温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反响的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进展反响，而且合成长引物还会大大增加合成费用。
〔2〕引物碱基构成 引物的G+C含量以40～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。，
上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5～10℃。假设按公式Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估计引物的Tm值，那么有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最正确。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在(一般不超过5个)。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
〔3〕引物二级构造 引物二级构造包括引物自身二聚体、发卡构造、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定构造的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡构造，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡构造的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环构造形式亦有很大的关系。应尽量防止3’末端有发卡构造的引物。
〔4〕引物3’端序列 引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反响的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反响几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链构造部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。应中选用3’端?G值较低〔绝对值不超过9〕，负值大，那么3’末端稳定性高，扩增效率更高。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链构造并引发DNA聚合反响。
需要注意的是，如扩增编码区域，引物3′端不要终止密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当防止在引物的3’端使用碱基A，最正确选择是G和C。
〔5〕引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响
3+扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列或参加其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便
于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。
〔6〕引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。 〔3〕．引物设计软件
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PCR扩增的原理和操作步骤
