Advances in Microbiology 微生物前沿, 2020, 9(2), 17-21
Published Online June 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/amb https://doi.org/10.12677/amb.2020.92003
Genotype Identification of a Strain of BK Virus
Qian Chen1, Shumin Zhu1,2, Sanfu Qu1,2, Songya Lv1*
12
State Key Laboratory of Virology, Wuhan University, Wuhan Hubei
China Typical Culture Preservation Center, Wuhan University, Wuhan Hubei
th
th
st
Received: May 5, 2020; accepted: May 25, 2020; published: Jun. 1, 2020
Abstract
The BK virus (BKV) is a polyomavirus first reported in 1971 and named after the patient. The BK virus has an invisible infection rate of 80% in adults. In recent years, diseases such as nephropa-thy, blood cystitis, and acute renal failure caused by BK virus have attracted increasing attention. There is currently no immune prevention strategy directed against BK virus, and there is no vac-cine against BK virus. In this paper, the results of sequencing and phylogenetic analysis of the VP1 gene of a BK virus from the China Center for Type Culture Collection, showed that the strain was I subtype Ib-1 strain. The identification results laid the foundation for further research and appli-cation of the virus.
Keywords
BK Virus, BK Virus-Related Diseases, Evolutionary Analysis
一株BK病毒的基因型鉴定
陈 倩1，朱淑敏1,2，屈三甫1,2，吕颂雅1*
12
武汉大学，病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 武汉大学，中国典型培养物保藏中心，湖北 武汉
收稿日期：2020年5月5日；录用日期：2020年5月25日；发布日期：2020年6月1日
摘 要
BK病毒(BKV)是一种多瘤病毒，最早在1971年报道，并用该病人姓名命名。BK病毒在成人中隐形感染
*
通讯作者。
文章引用: 陈倩, 朱淑敏, 屈三甫, 吕颂雅. 一株BK病毒的基因型鉴定[J]. 微生物前沿, 2020, 9(2): 17-21. DOI: 10.12677/amb.2020.92003
陈倩 等
率达到80%。近年来由BK病毒引起的肾病、血性膀胱炎、急性肾功能衰竭等疾病越来越引起关注。目前还没有直接针对BK病毒的免疫预防策略，不存在抗BK病毒的疫苗。本文对来源于中国典型培养物保藏中心的一株BK病毒的VP1基因进行了测序及进化树分析，结果表明该毒株为I亚型Ib-1毒株。本鉴定结果为该病毒的进一步研究和应用奠定了基础。
关键词
BK病毒，BK病毒相关疾病，进化分析
Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Open Access 1. 引言
BK病毒是多瘤病毒属成员，于1971年从肾移植病人尿液中分离得到[1]。全球的血清流行病学调查显示约80%成人血清呈阳性[2]。BK病毒初次感染多发生在幼儿时期，随后潜伏在泌尿生殖系统，如肾小管上皮细胞和尿路上皮细胞中，还可以潜伏在淋组织及肝、肺、眼、脑等组织器官。当感染者处于免疫抑制时，BK病毒会被激活，并随尿液排出。BK病毒的尿排出在免疫低下或免疫缺陷的个体中，如器官转移接受者、肿瘤患者、孕妇及艾滋病患者中极易被检出[3] [4] [5]。BKV的重新激活可引起的BK病毒相关肾病(BKVN)。Acott等[6]研究显示，在小儿肾移植术后受体发生BK病毒尿症的发生率为18%~50%，病毒血症的发生率为5%~16%，其中2%~8%的BK病毒血症可发展为BKVN，并因此造成高达50%的移植肾丢失率。除肾移植接受者外，BK多瘤病毒在骨髓移植接受者中也很常见，部分患者会出现出血性膀胱炎，甚至引发急性肾功能衰竭等疾病[7] [8]。
BK病毒为环状双链DNA病毒，无外膜包裹。BK病毒基因组由三个区域组成：早期区域编码大、小T抗原；晚期区域编码病毒外壳蛋白VP1~VP3；非编码控制区调控大T抗原的表达，后者在激活BK病毒复制、细胞识别和致癌性等方面发挥重要作用[9]。根据血清学或基因分型方法可将BK分离株分为四种亚型(I型~IV型)。I型是全球最常见的亚型(80%)，其次是IV亚型(15%)、II亚型和III亚型都少有报道[10]。Morel等基于VP1区域的100 bp序列(1977~2076)构建了一个算法，该算法能够快速确定99%的BKV子类型/子群，可将I亚型分为Ia、Ib-1、Ib-2、Ic毒株；IV亚型分为IVa-1、IVa-2、IVb-1、IVb-2、IVc-1、IVc-2毒株[11]。
本文对来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的一株名为GDV229 (保藏中心编号)的BK病毒的VP1基因进行了测序，系统发育分析表明，该病毒属于I亚型中的Ib-1 (图1)。本鉴定结果为该病毒的进一步研究和应用奠定了基础。
2. 材料与方法
1) 样本和细胞
BK毒株和Vero E6细胞均来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。 2) 病毒扩增
从CCTCC获得1份标本，将其接种到状态良好、密度为50%的Vero E6细胞，置于37℃，含5% CO2
的细胞培养箱中扩增。盲传三代后出现细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)。
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Figure 1. Phylogenetic analysis of the VP1 region of GDV229 图1. GDV229的VP1区域系统发育分析
3) RNA提取、RT-PCR、测序
待感染的细胞出现CPE现象，即收集细胞并从中提取DNA，根据BKV的保守序列设计引物进行PCR [12]，扩增DNA片段。如表1所示，使用引物(BKV VP1-F和BKV VP1-R)扩增GDV229的VP1基因全序列。用E.Z.N.A Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(购买于Omega公司)回收PCR产物。将回收的DNA产物送去测序公司测序。
Table 1. Primer sequences used to amplify the VP1 region of BKV 表1. 扩增BKV的VP1区所用引物序列
Primer BKV VP1-F BKV VP1-R
Sequence
CTACTGATGTGGGAGGCTGTAACAG TAAACCATTTTAGTTTGCAATTGTCC
Site 1873~1897 2614~2639
4) 序列收集和系统发育分析
为了进行系统发育分析，我们从GenBank下载了95个已经基因分型的BKV的VP1基因序列。结合本实验室分离的1个序列，共96条序列用于系统发育分析。
导出可于MEGA-X分析软件的meg.格式，用MEGA-X中的Clustal W程序对 BKV毒株进行VP1全序列比对。采用邻接法建立基于部分VP1基因的系统发育树。使用500次重复的bootstrap分析评估每个分支的统计支持。用P距离模型计算遗传距离。
3. 结果
3.1. BK病毒的VP1基因序列
从CCTCC获得GDV229，将其接种到状态良好、密度适中的Vero E6细胞上进行扩增。使用引物(BKV
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VP1-F和BKV VP1-R)扩增GDV229的VP1基因全序列，测序所得的1882~2632位点的基因序列信息为：
GGGTGGGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATTGGTGAGCTGTAACAGTACAAACAGAGGTCATTGGAATAACTAGCATGCTTAACCTTCATGCAGGGTCACAAAAAGTGCATGAGCATGGTGGAGGTAAACCTATTCAAGGCAGTAATTTCCACTTCTTTGCTGTTGGTGGAGACCCCTTGGAAATGCAGGGAGTGCTAATGAATTACAGGACCAAGTACCCAGATGGTACTATAACCCCAAAAAACCCAACAGCCCAGTCCCAGGTAATGAATACTGACCATAAGGCCTATTTGGACAAAAACAATGCTTATCCAGTTGAGTGCTGGGTTCCTGATCCTAGTAGAAATGAAAATACTAGGTATTTTGGGACTTTCACAGGAGGGGAAAATGTTCCCCCAGTACTTCATGTGACCAACACAGCTACCACAGTGTTGCTAGATGAACAGGGTGTGGGGCCTCTTTGTAAAGCTGATAGCCTGTATGTTTCAGCTGCTGATATTTGTGGCCTGTTTACTAACAGCTCTGGAACACAACAGTGGAGAGGCCTTGCAAGATATTTTAAGATTCCGCCTGAGAAAAAAGATCTGTAAAAAATCCTTACCCAATTTCCTTTTTTGCTAAGTGACCTTATAAACAGGAGAACCCCAGAAGAGTGGATGGGCAGCCTATGGTATGGTATGGAATCCCCAGGTAGAAGAGGGTTAAGGGGTGTTTGAATGGCACAGAAAAGACTTCCCAGGGGACCCCAGATATGATAAGATATATTGATAAACAAGGACATTGCAACTAAAAAAAGGGGGGGTAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTCC。
3.2. 根据VP1基因序列分析所得的BK病毒系统发育
为了确定我们所得BK病毒的分型，我们从GenBank下载了95个已经基因分型的BKV的VP1基因序列。结合本次分离的1个序列，共96条序列用于系统发育分析。用MEGA-X中的Clustal W程序对BKV毒株进行VP1全序列比对，采用邻接法建立基于部分VP1基因的系统发育树(图1)。
BKV-VP1基因区域的系统发育分析结果表明：GDV229属于BK病毒I亚型Ib-1毒株。这一结果也进一步印证了I亚型BK病毒在临床中最为常见。
4. 讨论
许多国家已经研究了BKV亚型和亚群在人种群中的分布。Takasaka等利用BK病毒的TCR区构建的系统发育分析发现：从日本分离出的BK病毒多为Ic毒株[13]。Krumbholz和Ikegaya研究表明：Ia亚群在非洲高度流行，Ib-1亚群在东南亚高度流行，Ib-2亚群在欧洲高度流行[14] [15]。这些提示BK病毒亚型的子群可能与人类种群相关。我们的研究结果鉴定了一株中国BK病毒的Ib-1毒株，这一结果也进一步印证了I亚型BK病毒在临床中最为常见。本鉴定结果为该病毒的进一步研究和应用奠定了基础。
基金项目
国家实验细胞资源共享服务平台项目(NSTI-CR18)。
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