A549细胞培养方案 - 适用于各种细胞培养

A549细胞的培养

A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。

一、 [所需溶液]

1，

细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg

NACL 8.00g； KCL 0.20g; KH2PO4 0.20g; Na2HPO4 .。12H2O 1.15g 加水至 1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。 2，

消化液

（1） 胰酶-PBS

结晶胰酶 2.5g; 高压灭菌后的PBS 1000ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。 （2） 胰酶—EDTA:

结晶胰酶 0.5g; EDTA盐溶液 0.2g 无Ca、Mg PBS 1 000ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除

菌，分装备用，放置—20℃保存。 3，

细胞培养液：RPMI 1640培养液

配制方法：

（1） 将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900ml三蒸水中，冲洗包

装袋两至三次倒入培养液中。

（2） 加入丙酮酸钠 0.1g，NaHCO2 2g以及双抗，加入磁力搅棒并置

于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80 万 U/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；市售的链霉素为100 万 U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml)。

（3） 调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察 ＰＨ７.２～７.

４即可。

（4） 过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ２加压过滤，０.２２μｍ滤膜，

滤膜事先采用高压灭菌消毒。

（5） 分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置—20℃保存。

二、［细胞的维持和培养］

１， 细胞的复苏

（１） 准备一个盛有３７℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ

５４９细胞的冻存管，放于３７℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。

（２） 1000～２000 r，3～５min离心。

（３） 在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打

开冻存管，注意动作要轻柔。

（４） 用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将

细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。

（５） 补充4ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。 （６） 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 （７） 24h后，更换新的培养液。 （８） 常规传代培养。 ２， A549细胞更换新的培养液

（１） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 （２） 用PBS反复冲洗细胞2～3遍。

（３） 加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。

各种液体需要量（ml）

表面积 25cm2 75cm2 150cm2 洗涤 3 5 10 胰酶 1～2 1～3 2～5 培养液 5 10 20 （４） 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 ３， A549细胞的传代

（１） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

（２） 向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，

使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表

面2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。

（３） 加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～８min后把培

养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。

（４） 加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分

散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。

（５） 吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培

养液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5～10ml。

（６） 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 注意事项：

（１） 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应

调整PH至7.2左右，均不能超过7.4。

（２） 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，

否则会损伤细胞。

（３） 严格执行无菌操作的要求。

（４） 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可

多添加些含牛血清的培养液中和。 （５） 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。 ４， A549细胞的冻存

（１） 消化已生长融合的单层细胞。

（２） 用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲

基亚砜)。分装在2ml容积的冻存管中。

（３） 用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中

过夜。

（４） 放入液氮中冻存。