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基因工程的定义word资料12页

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1. 基因工程的定义:在体外对不同生物的遗传物质(基因)进行剪切、重组、连接,然后插入到载体分子中(细菌质粒、病毒或噬菌体DNA),转入微生物、植物或动物细胞

内进行无性繁殖,并表达出基因产物。

2. 碱抽提法提取质粒DNA 原理和步骤 3、DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法

2. 琼脂糖凝胶电泳估计

原理:

3. DNA的凝胶电泳的原理

相同分子量的DNA:

闭合环状卷曲超螺旋迁移最快, 线性分子次之, 伸展开环状最慢。

4. 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4—8bp),并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 功能

即在核酸分子链的内部制造切口的酶。

自我保护作用。用来保护宿主不受外来DNA的感染,可降解外来的DNA,从而阻止其复制和整合到细胞中。

目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点 I 型限制性内切酶

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II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶

粘性末端(sticky ends,cohensive ends)含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型:5’端凸出(如EcoR I切点);’端凸出(如Pst I切点) 限制性内切酶识别的序列

1. 长度:一般为4-8个碱基,最常见的为6个碱基。

? 4个碱基:sau3AⅠ ? 5 个碱基:EcoRⅡ ? 6个碱基:EcoRⅠ ? 7个碱基:BbvCⅠ ? 8个碱基:NotⅠ

限制酶识别序列的结构

大多数为回文对称结构,切割位点在DNA两条链相对称的位置。 有些识别非对称序列,

有些可以识别多种序列,ACCⅠ识别序列是GT ü MKAC,可以识别4中序列; 有些识别的序列呈间断对称,对称序列之间含有若干任意碱基 位点偏爱 (site preferences)

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割,即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。

酶切反应条件 缓冲液,反应温度,反应时间,反应中止 星星活性(star activity)

在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的

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特殊性称星星活性。 引起星星活性的因素 ① 高浓度甘油(>5%) ② 酶过量(>100U/mg) ③ 低离子强度(<25mM) ④ 高pH (>pH8.0) ⑤ 有机溶剂

PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide)、sulphalane ⑥ 用其它二价阳离子代替Mg++ Mn++,Cu++,Co++, Zn++

不同的酶对上述条件的敏感性不一样

PstI比EcoRI对高pH更敏感,但后者对甘油浓度更敏感

同裂酶(Isoschizomers)

识别相同序列的限制性内切酶,但它们的切割位点可能不同。 同尾酶(Isocaudamers)

识别的序列不同,但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等

影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项 1. DNA的纯度

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2. DNA的甲基化程度 3. 温度

4. 缓冲液(Buffer) T4DNA 连接酶的功能

主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA 5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键,使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。 大肠杆菌DNA聚合酶 I ①一条单链多肽。

②5’?3’外切酶活性位于N端。 5’?3’DNA聚合酶活性

DNA聚合酶 3’?5’外切5’?3’外切聚合速持续能酶活性 酶活性 有 无 无 无 无 无 无 有 率 中 中 中 快 快 快 低 快 力 低 低 低 高 高 高 中 高 大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow fragment T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 化学修饰T7DNA聚合酶 遗传修饰T7DNA聚合酶 逆转录酶 Taq DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性

低 低 高 高 低 无 无 无 第 4 页

在没有dNTP的情况下,外切活性占主导地位,而当存在足够的dNTP时,外切活性和合成活性将处在动态平衡中,结果使得dsDNA成为平末端。 Klenow fragment

具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。(失去了5’?3’外切酶活性)。

在蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)裂解, 从全酶中除去5’—3’外切活性片段,而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响。 逆转录酶

依赖RNA的DNA聚合酶(RNA指导的DNA聚合酶)。 来源 RNA肿瘤病毒。 AMV的性质

二链多肽(62kDa/94kDa) 具5’ →3’DNA聚合活性

具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA) 碱性磷酸酶

该酶可从DNA分子的5’端去除磷酸基

碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5’磷酸,以防止自身连接。 核酸分子杂交定义

用标记的已知DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知核酸序列,通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合,再经显影或显色的方法,将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列,可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基

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1.基因工程的定义:在体外对不同生物的遗传物质(基因)进行剪切、重组、连接,然后插入到载体分子中(细菌质粒、病毒或噬菌体DNA),转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖,并表达出基因产物。2.碱抽提法提取质粒DNA原理和步骤3、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法2.琼脂糖凝胶电泳估计原理:3.
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