酵母单基因重金属过量表型验证
目的：
验证目的基因D在酵母菌株ycf1中是否为耐重金属（K2Cr2O7）基因。 方法：
将验证为阳性的ycf1、ycf1-pYSE2-D、ycf1-pYSE2-NTB酵母菌株，通过酵母表型验证实验，判断目的基因D是否为抗重金属（K2Cr2O7）基因。 材料：
1．酵母甘油菌：ycf1、ycf1-pYSE2-D、ycf1-pYSE2-NTB 2．培养基：
1). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook，其中各种培养基分别以下列符号表示：SD-U：-Ura；SG-U：-Ura 3).重铬酸钾K2Cr2O7：
配制好SG-U固体培养基后加入，培养基中的六价铬终浓度为0、5、10、15、20、30、40、60 mg/L 1.1酵母活化
用移液器吸取适量ycf1-pYES2-D甘油菌涂板至SD-Ura固体培养基上，放置到温度为30℃培养箱中培养，3天后观察平板并拍照。图片如下。
1.2 阳性克隆 PCR验证
从长好的平板上随机挑取8点，进行划线保菌并PCR验证。图片如下。
1.3 酵母表型验证
1. 从验证成功的酵母单菌落中，随机挑取一个单菌落接种于4 ml SD-Ura液体
培养基，30℃，225 rpm，振荡培养24 h左右，至OD600大于1.0（阴性对照也是用同样的方法摇菌）。
2. 菌液浓度测定。将菌液初始浓度统一调至OD600=0.8-1.0，然后按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行稀释。
3. 稀释后的菌液点板到含0、5、10、15、20、30、40、60mg/L K2Cr2O7的SG-Ura平板上，放置到温度为30℃培养箱中培养，3天后观察平板并拍照。图片如下。
单基因验证结题报告模板
