干露和再入水对克氏原螯虾抗氧化应激能力的影响 

干露和再入水对克氏原螯虾抗氧化应激能力的影响

王海锋1, 2, 3，成永旭1, 2, 3，李京昊1, 2, 3，奚业文4，李嘉尧1, 2, 3

【摘 要】摘要： 为研究虾苗运输中干露胁迫对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的影响，实验在(20±1) ℃和相对湿度 (relative humidity, RH) (50±5)% 的条件下，对不同干露时间(6 h、12 h、18 h 和24 h)和再入水时长(1 h、6 h 和12 h)幼虾的抗氧化应激能力和成活率进行了研究。结果显示，幼虾的干露时间不宜超过18 h，第24 小时死亡率达到53.3%，入水阶段无幼虾死亡。干露阶段，总抗氧化能力(T-AOC) 无显著变化(P＞0.05)；超氧化物歧化酶(SOD)活力显著降低；过氧化氢酶(CAT)活力随时间逐渐升高；丙二醛(MDA)质量摩尔浓度在干露第24 小时后达到峰值(P＜0.05)；血糖和肌肉乳酸浓度随干露时间显著升高(P＜0.05)。再入水时，SOD 和CAT 呈波动性变化，无明显规律；入水12 h 后MDA 均恢复到对照组水平；T-AOC 一直维持较高水平。6 h 和12 h 组入水1 h后乳酸即恢复到对照组水平，各处理组的血糖始终高于对照组(P＜0.05)。研究表明，CAT 和SOD 对干露胁迫的反应更为敏感，可作为克氏原螯虾干露阶段的免疫指标。MDA、血糖和肌肉乳酸浓度可以反映幼虾再入水时的健康状况。【期刊名称】《南方水产科学》【年(卷),期】2024(015)005【总页数】8

【关键词】 克氏原螯虾；干露胁迫；再入水；氧化应激开放科学（资源服务）标识码（OSID）：修回日期：2024-04-30

资助项目：江苏省渔业科技类项目“稻渔综合种养技术研究与集成示范”(D2017-1-1)；上海市科委农业领域科技支撑项目“崇明稻-小龙虾综合种养模式下的选育及养殖示范”(15391912100)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-48)；上海市高水平大学建设研究项目(A1-2801-18-1003)；内江市科技孵化和成果转化专项资金(2024KJFHO22)

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾，2017 年我国克氏原螯虾的产量达到112.97×104 t[1]，连续两年成为甲壳类淡水养殖第一品种。苗种运输是克氏原螯虾养殖生产过程中的重要环节，实际养殖生产中克氏原螯虾以干法运输为主[2]。干法运输即无水运输，它利用了克氏原螯虾抗缺水能力较强的特点。

在干法运输过程中，克氏原螯虾离开水体处于干露状态，随着时间的延长会对机体造成干露胁迫。目前已有对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、日本囊对虾(Penaeus japonicus)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)等甲壳动物干露方面的研究[3-5]，而关于克氏原螯虾干露方面的研究尚未见报道。研究表明干露条件下，低氧、盐度、pH、失水等环境胁迫因子的联合作用引发了水产

动物强烈的应激反应[4]。Omori 等[6]认为蟹类的干露耐受能力由鳃的保水能力所决定，姜令绪等[3]研究表明三疣梭子蟹干露耐受性取决于温、湿度条件和幼体的发育阶段。在运输过程中，水生动物会通过调节血糖升高以适应各种胁迫[7]，随着干露时间的延长，无氧代谢参与其中导致体内乳酸浓度上升[8]。姜娜等[4]发现干露胁迫下，三疣梭子蟹肝胰腺的总抗氧化能力(T-AOC)和机体胁迫程度有显著相关性；段亚飞等[9]认为谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)可作为日本囊对虾干露胁迫下的免疫监测指标。本文主要研究了不同干露时间胁迫和再入水过程中，克氏原螯虾血糖、肌肉乳酸、SOD、CAT、T-AOC、MDA 和死亡率的变化，旨在选出与克氏原螯虾干露耐受性相关的健康指标，为干法运输改良和养殖监测提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

克氏原螯虾幼虾取自上海海洋大学崇明基地，体质量为(8.7±0.4) g。幼虾暂养于循环水族缸(180 cm×180 cm×80 cm)中，时间为1 周。养殖水温为(20±1) ℃、pH 为7.6±0.3、光暗周期为14 h∶10 h、持续充氧，每天投喂配合饲料(浙江欣欣饲料有限公司)。干露容器为450 mL 的PP 塑料盒(8.8 cm×6.3 cm×12.0 cm)。1.2 实验设计

克氏原螯虾幼虾干露实验在室内进行，配备了空调和抽湿机，温度为(20±1) ℃，相对湿度(relative humidity, RH)为(50±5)%。根据预实验的结果设4 个干露时间组(6 h、12 h、18 h 和24 h) 和1 个对照组(无干露处理)，每组80 尾幼虾，干露结束后记录各组成活率并在存活个体中随机抽取6 尾用于酶活等指标测定，再将各组剩余的幼虾进行再入水处理，分别在第1、第6 和第12 小时随机抽取6 尾幼虾用于酶活等指标测定并记录各组成活率。1.3 实验方法

克氏原螯虾置于解剖盘上，用吸水纸擦干体表，将1 mL 的注射器针头插入幼虾的附肢关节膜，抽取血液于2 mL 的离心管中。剪开头胸甲和腹部取出肝胰腺和肌肉，用2 mL 的离心管分装完后立即放入液氮里冻存，最后均保存于-80 ℃冰箱中待测。

肌肉和肝胰腺粗酶液的制备：取肝胰腺或肌肉样品称质量，移液枪取9 倍于组织块的预冷匀浆介质，用电动匀浆器冰浴匀浆，充分匀浆后用4 ℃低温离心机8 000 r·min-1 离心10 min，取上清液即为粗酶液，之后放入-80 ℃冰箱保存备用，用于组织酶活力的测定。

血清的制备：取出冻存的血淋巴样品，待样品融化后，用电动匀浆器冰浴匀浆，充分匀浆后用4 ℃低温离心机10 000 r·min-1 离心10 min，取上清液即为血清待测液。1.4 指标测定

T-AOC、SOD、CAT 和MDA 均采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行测定。T-AOC 的单位定义为37 ℃条件下，样品组织使反应体系的吸光度(OD)每增加0.066 时，为1 个总抗氧化能力单位(U·g-1)。SOD 活力测定采用NBT 法，单位定义为在反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD 酶活力定义为1 个酶活力单位(U·g-1)。CAT 酶活的单位定义为每克组织每分钟催化1 mol 的H2O2 降解定义为1 个酶活力单位。MDA 质量摩尔浓度(nmol·g-1)采用硫代巴比妥酸(TAB) 法测定。血糖(μmol·mL-1) 和乳酸(μmol·g-1)采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒进行测定，具体方法按照试剂盒说明书进行。1.5 数据分析

实验数据均以“平均值±标准差”表示，结果用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA) 和Duncan 检验进行多重比较，P＜0.05 表示有显著性差异。

2 结果

2.1 干露胁迫和再入水对死亡率的影响

不同干露时间胁迫下克氏原螯虾累积成活率见图1。干露6 h 和12 h 组的幼虾成活率均为100%，干露过程中大部分时间表现为静止状态，身体蜷缩，用镊子触碰后立即张开螯足，作防御姿态，活力正常。18 h 组的幼虾无个体死亡，但在干露过程中会有间歇性“躁动”现象：尝试从容器中爬出，触碰后反应迟钝。24 h 组幼虾开始出现死亡(成活率为53.3%)，表现为第二触角的顶端会明显卷曲，咀嚼器附近分泌出许多泡沫。

4 个干露时间组的幼虾再入水成活率均为100%，其中12 h、18 h 和24 h 组的幼虾入水时会漂浮于水面，约2 min 后再完全沉入水体。2.2 干露胁迫和再入水对血糖浓度的影响

克氏原螯虾血糖浓度随着干露时间的延长逐渐升高(图2-a)。干露第6 小时血糖浓度显著上升(P＜0.05)，之后持续升高，在第24 小时达到最高值(4.08 μmol·mL-1)，是对照组(0.54 μmol·mL-1)的7.5 倍，而且各处理组之间差异显著(P＜0.05)。

再入水阶段(图2-b)，干露6 h 组入水第1 小时血糖浓度显著上升(P＜0.05)，第6 小时略有下降，入水第12 小时达到峰值(1.15 μmol·mL-1)。干露12 h 组的血糖浓度呈下降趋势，第12 小时达到最低值(0.94 μmol·mL-1)，但仍显著高于对照组(P＜0.05)。干露18 h 组的血糖浓度呈下降趋势，入水1 h 后显著高于对照组，入水第6 小时开始降低，但仍显著高于对照组，入水第12 小时又有所回升。干露24 h 组入水第1 小时血糖浓度显著高于对照组水平，入水第6 小时达到峰值(1.05 μmol·mL-1)，入水第12 小时又有所下降。

2.3 干露胁迫和再入水对肌肉乳酸浓度的影响

克氏原螯虾干露后肌肉乳酸浓度见图3-a。与对照组(1.67 μmol·mL-1)相比，干露第6 小时幼虾乳酸

浓度(4.75 μmol·mL-1)显著升高(P＜0.05)。在干露第12 和第18 小时，乳酸浓度一直维持在较高水平，和对照组有显著性差异。干露第24 小时达到最高(5.2 μmol·mL-1)，但各组之间没有显著差异(P＞0.05)。

干露6 h 组和12 h 组入水第1 小时乳酸浓度即降低到对照组水平(图3-b)，在入水第6 和第12 小时略有升高，但与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。干露18 h 和24 h 组的乳酸浓度呈逐渐下降的趋势，入水第1 小时显著高于对照组(P＜0.05)，入水第6 和第12 小时略有下降，但仍显著高于对照组(P＜0.05)。

2.4 干露胁迫和再入水对CAT 活力的影响

克氏原螯虾肝胰腺中CAT 活力随着干露时间的延长逐渐升高(图4-a)。CAT 活力从干露第12小时开始显著高于对照组(P＜0.05)，之后维持此水平至第18 小时。干露第24 小时CAT 活力达到最高[190 nmol·(min·g)-1]，是对照组[37 nmol·(min·g)-1]的5 倍，且CAT 活力显著高于其他3 个处理组(P＜0.05)。

克氏原螯虾干露后入水阶段肝胰腺CAT 活力见图4-b。干露6 h 组入水后CAT 活力一直维持较高水平，显著高于对照组(P＜0.05)。干露12 h 组在入水第6 小时CAT 活力达到最大值，在入水第12 小时恢复至对照组水平。干露18 h 组CAT 活力逐渐下降，在入水第12 小时恢复到对照组水平。干露24 h 组CAT 活力随着入水时间的延长逐渐升高，在入水第12 小时达到最大值。2.5 干露胁迫和再入水对SOD 活力的影响

克氏原螯虾肝胰腺SOD 活力的变化见图5-a。与对照组相比，干露第6 小时SOD 活力显著下降(P＜0.05)，之后一直维持较低水平，在干露第24 小时有明显上升，但仍显著低于对照组水平。干露6 h 组在入水第1 小时SOD 活力显著低于对照组(P＜0.05)，入水第12 小时酶活力达到最高(243 U·g-1)，但仍显著低于对照组水平。12 h 组再入水阶段SOD 活力显著低于对照组水平(P＜0.05)，呈逐渐下降的趋势。干露18 h 组入水第1 小时SOD 活力显著低于对照组，入水第6 小时略有下降，在第12 小时明显升高，酶活力达到峰值(371 U·g-1)，但仍显著低于对照组水平(466 U·g-1)。干露24 h 组SOD 活力在入水第6 小时(389 U·g-1)升高到对照组水平，之后在第12 小时又明显降低，显著低于对照组(图5-b)。2.6 干露胁迫和再入水对T-AOC 水平的影响

与对照组相比，克氏原螯虾肝胰腺中T-AOC水平随着干露时间的延长无显著性变化(P＞0.05)，而且各组之间也无显著性差异(图6-a)。

干露6 h 组T-AOC 水平在入水阶段有逐渐上升的趋势(图6-b)，入水第6 小时开始显著高于对照组(85 U·g-1)，在第12 小时达到最高值(132 U·g-1)。干露12 h 组T-AOC 水平呈先下降再升高的趋势，在入水第1 小时显著高于对照组，第6 小时又下降到对照组水平，之后在第12 小时又显著上升(P＜0.05)到最大值(127 U·g-1)。干露18 h 组T-AOC 水平在入水第1 小时显著高于对照组

(P＜0.05)，之后一直维持较高水平，在入水第12 小时达到最大值(137 U·g-1)。干露24 h 组T-AOC 水平入水第1 小时显著升高(P＜0.05)，随后开始下降，在入水第12 小时降至对照组水平。2.7 干露胁迫和再入水对MDA 质量摩尔浓度的影响

干露胁迫对克氏原螯虾肝胰腺MDA 质量摩尔浓度的影响见图7-a。MDA 质量摩尔浓度随着干露时间的延长整体呈上升趋势。与对照组相比，前3 个处理组的MDA 质量摩尔浓度均无显著性差异(P＞0.05)。干露第24 小时达到最大值(31 nmol·g-1)，且显著高于对照组(18 nmol·g-1)。干露6 h 组MDA 质量摩尔浓度在再入水阶段呈先升高再下降的趋势(图7-b)，入水第6 小时达到最大值(25 nmol·g-1)，但与对照组之间无显著差异(P＞0.05)。干露12 h 和18 h 组入水后MDA 质量摩尔浓度逐渐上升，但与对照组相比无显著性差异。干露24 h 组MDA 质量摩尔浓度呈逐渐下降的趋势，入水第1 小时显著升高(P＜0.05)，并达到最大值(30 nmol·g-1)，入水第6 小时略有下降，但仍显著高于对照组，入水第12 小时降低到对照组水平。

3 讨论

3.1 干露胁迫和再入水对克氏原螯虾成活率的影响

在本实验的温、湿度(20 ℃，50% RH)条件下，克氏原螯虾干露18 h 的成活率为100%，干露24 h 成活率降为53.3%。说明克氏原螯虾幼虾具有一定的干露耐受能力，但干露时间不宜超过18 h。实验中观察到，当幼虾的第二触角开始卷曲，咀嚼器附近有泡沫液体分泌时，幼虾会在短时间内死亡，这可能是幼虾遭受严重胁迫的信号。有研究认为蟹类干露后再入水过程中会排出体内代谢物，重新建立酸碱平衡，鳃小节体液再灌注，恢复至正常水平[10]。但是当再入水阶段发生氧化应激，一些重要的血淋巴物质超过了机体耐受，就会造成机体死亡[11-12]。值得注意的是，本实验中即使干露24 h 组的幼虾死亡率已接近50%，入水成活率仍达到100%。说明克氏原螯虾对于干露再入水时的氧化应激有较强的抵抗能力。

3.2 干露胁迫和再入水对克氏原螯虾抗氧化能力的影响

动物机体的抗氧化水平，一定程度上反映了机体的健康状况。氧自由基(ROS)是机体代谢过程中排出外源物质和抗应激反应时的产物[13]，包括超氧离子自由基()、羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)。当机体内的抗氧化酶系统不能及时清除过量的ROS，就会造成氧化损伤[14]。肝胰腺作为甲壳动物氧化代谢的主要场所，抗氧化酶的水平较高，也是产生大量ROS 的器官[15]。因此，本实验主要通过肝胰腺抗氧化酶活的变化来评估幼虾干露胁迫和再入水阶段的健康状况。

总抗氧化能力(T-AOC)主要包括机体内的抗氧化酶体系和抗氧化物质体系，也是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[16]。SOD 是主要的清除剂，可以与发生歧化反应，生成H2O2 和O2，CAT 再将H2O2 分解生成H2O 和O2，2 种酶之间相互协同，抑制细胞膜脂氧化，减少氧化损伤[13]。本实验发现，SOD 活力在干露阶段始终维持较低水平，分析可能是干露引起幼虾机体内产生了过量的ROS，SOD 被用来还原导致SOD 急剧减少[17-18]。CAT 活力随着干露时间的延长逐