药用植物内生真菌的研究进展
作者：谢海伟 冯嘉琪 付晓晴 江坤生 陈佳茹 来源：《江苏农业科学》2020年第14期
摘要：植物内生真菌广泛存在于药用植物体内，具有丰富的生物多样性，对寄主植物有着积极的作用，内生真菌的次生代谢产物有着抗肿瘤、抗氧化、抗菌等活性，在医药、农业、食品等行业有着巨大的应用前景。本文综述了近年来药用植物内生真菌的研究进展，在药用植物内生真菌的分离筛选技术、检测方法、鉴定技术等方面进行阐述，在药用植物内生真菌的种属多样性、代谢产物生物多样性方面进行分析;对药用植物内生真菌在医药行业和农业中的应用等进行总结，并对现今药用植物内生真菌的相关研究存在的问题进行分析，并对内生真菌的未来应用提出展望。
关键词：药用植物;内生真菌;分离筛选;多样性;应用
中图分类号： Q949.95;S182; 文献标志码： A; 文章编号：1002-1302（2020）14-0001-05 收稿日期：2019-07-24
药用植物内生真菌是天然药物的重要组成部分，其活性代谢产物丰富多样，包括各种结构类型独特、具有潜在应用前景的活性物质，已成为发现新高效、新颖、低毒的天然活性物质的重要资源。目前发现内生真菌的种类多达100万种[1]。目前的主要研究集中于宿主植物与内生真菌共生机制和内生真菌天然代谢产物的功能关系等方面，植物内生真菌的次级代谢产物具有抗氧化性、抑制病原微生物、抗肿瘤、抗虫等功能，能被广泛应用于医药、农业、环境保护等方面。近年来，药用植物的内生菌已成为研究热点之一，如内生真菌天然代谢产物的生物活性、药用内生真菌促进新型药物的开发、药用植物内生真菌的次级代谢产物对宿主植物的生长和抗病虫害机制等方面的研究。而药用植物内生真菌在药用、医用等方面的作用更为显著，部分药用内生真菌可以分泌与寄主相同或相似的药用成分。在药用植物自然更新慢、有效药用成分提取率低、人为采取过度导致生物多样性降低的背景下，开发药用内生真菌是一个有效保护珍稀药用植物、大规模开发生产药用活性成分的途径。本文以药用植物内生真菌为对象，就其分离筛选、多样性、在不同行业中应用及存在的问题进行分析和阐述。 1 药用植物内生真菌筛选
药用植物内生真菌分离流程包括药用植物样本采集，样本消毒处理，内生真菌的分离及培养，内生真菌的鉴定，内生真菌及代谢产物性能分析。 1.1 药用植物内生真菌筛选预处理
药用植物内生真菌分离筛选预处理是控制药用植物表面的杀菌强度，防止誤杀部分内生真菌或者混入表生真菌，影响植物内生菌分离效果的操作。根据植物类别及植物组织类型，可以采用75%乙醇+次氯酸钠溶液的表面消毒和75%乙醇+氯化汞2种表面消毒方式。75%乙醇与氯化汞的结合消毒较彻底，缺点是氯化汞的毒性大并且对环境有一定的危害作用。Adeyemi等在研究内生真菌筛选时发现，在彻底表面灭菌的前提下，杀菌剂高浓度短时间处理，药用植物内生真菌的分离效果更显著[2]。药用植物内生真菌的表面灭菌效果检测方法有3种，分别是漂洗液检验法、组织印迹法和超净工作台无菌状态检测对照法。 1.2 药用植物内生真菌分离筛选
药用植物内生真菌的分离筛选一般是采用组织分离法和研磨涂布法，其中组织分离法的操作工序较为简便，因此目前多采用组织分离法。分离药用植物内生真菌的常用培养基有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）[3]、玉米粉琼脂（CMA）、麦秆煎液琼脂（WSA）、麦芽浸出液琼脂、水琼脂（WA）、沙氏葡萄糖琼脂、沙氏麦芽糖琼脂、以及查氏琼脂（CAZ）培养基，其中以PDA培养基最为常用。此外在培养基中加入100 μg/mL氨苄青霉素或（和）100 μg/mL硫酸链霉素等抗生素可有效抑制细菌的生长。分离出的内生真菌一般采用PDA培养基纯化培养。章苗等采用拮抗试验和体外抗菌测试方法，利用马铃薯葡萄糖双抗培养基在22 ℃低温条件培养下从无患子内成功筛选出6株内生真菌[3]。药用植物内生真菌的筛选包括内生真菌产生长激素活性物质筛选、内生菌拮抗病原真菌筛选、抑菌活性筛选、抗肿瘤细胞活性筛选以及促生特性的筛选等。张亮等对分离得到的杜仲内生真菌进行活性筛选，发现有18个菌株对病原真菌具有显著的拮抗作用[4]。魏练平等从山苍子叶中分离筛选出2株内生真菌，它们对人肝癌HepG2细胞有明显抑制作用[5]。 1.3 药用植物内生真菌的鉴定
药用植物内生真菌的鉴定方法主要有形态学鉴定、理化鉴定和分子生物学鉴定，具体包括[6]：（1）形态学鉴定。主要根据菌株个体和菌落群体的形态特征进行鉴定，观察内生真菌菌落的形状、大小、颜色等特征，结合在光学显微镜或电子扫描电镜下观察到的菌株个体的孢子、产孢结构等特征，依据真菌鉴定手册对其进行鉴定。（2）酶联免疫吸附剂测定
（ELISA）法。ELISA技术因准确度高、特异性强、适用范围广、检测样本多、速度快，并且条件要求比较低，方便操作，被广泛运用在药用内生真菌的检测分析上。（3）利用次生代谢物间接检测。产生次生代谢物是药用内生真菌最重要的特征，也是采用这种方法检测内生真菌的重要依据。通过气相色谱（GC）、质谱方法（MS）以及高效液相色谱法（HPLC）检测次生代谢物的含量可间接地检测内生真菌。这些药用内生真菌次生代谢产物的检测方法可间接证明内生真菌是否存在。（4）分子检测法。可以通过保守基因测序进行内生真菌种类鉴定;通过各种分子标记技术进行内生真菌基因型分析;通过高通量测序技术、基因组测序技术，对内生真菌的系统进化进行深入分析，可为寻找内生真菌与药用植物相互作用的基因奠定重要的基础。
2 药用植物内生真菌多样性的研究 2.1 内生真菌种属类型
近年来，科学家从各种药用植物当中分离出来的内生真菌共171属。植物内生真菌丰富多样，大多数植物体内含有内生真菌，且种类繁多。在多数植物中，内生真菌分属于以下几个属，即拟隐孢霉属、拟茎点霉属、半壳霉属、叶点霉属等。目前研究的植物内生真菌绝大多数属于子囊菌类的核菌纲、腔菌纲和盘菌纲，无孢菌群的多类真菌和半知菌中的链格孢属、青霉属、镰刀菌属等。
孙璐等从毛序棘豆的根、茎和叶中分离得到的内生真菌共有29株，经鉴定分属于4纲、5目、6科、10属，优势菌属是镰刀菌属和链格孢属，分布最广泛的为木霉菌属[7]。艾洪莲等从马铃薯植株中分离得到44株具有生物活性的内生真菌，分属于21个属，分别是毛壳菌属、篮状菌属、曲霉属、链格孢属、螺旋聚孢霉属、裂褶菌属、枝孢属、单端孢属、茎点霉属、离蠕孢属、壳二孢属、炭角菌属、白僵菌属、镰孢菌属、附球菌属等，其中毛壳菌属、篮状菌属和附球菌属为优势菌属[8]。李盼盼等从传统药用植物烟草中共分离得到539株内生真菌，经过rDNA-ITS系统发育分析鉴定为31属、73种，其中曲霉属和镰孢属为烟草的优势菌群[9]。唐青等从艾纳香的根、茎和叶中分离得到内生真菌共152株，经鉴定分属于11个属，分别是镰刀菌属、木霉菌属、脉孢菌属、间座壳属、多节孢属、曲霉属、青霉属、弯孢菌属、茎点霉属、烟管霉属和蜡质菌属，其中镰刀菌属、曲霉属、木霉菌属和弯孢菌属为艾纳香内生真菌的优势菌属[10]。Manganyi采用形态学和分子生物学技术研究天竺葵内生真菌的生物多样性，共分离鉴定出真菌133株，其中青霉属真菌占优势[11]。 2.2 内生真菌组织分布多样性
药用植物内生真菌的多样性决定了其次生代谢產物的多样性。内生真菌在药用植物中存在组织分布差异性。裴枭鑫等从黑果枸杞植株的果、根、茎、叶中分离得到内生真菌43株[12]。曹丹丹等从茎直黄芪中分离得到内生真菌336株，研究表明，茎直黄芪不同组织部位内生真菌多样性指数不同，其中花中的多样性指数最高，叶次之，茎最低[13]。刘军等从檀香中分离到325株檀香内生菌，其中根部内生真菌的物种多样性明显较茎和叶丰富[14]。岳海梅等从西藏砂生槐中分离出77株内生真菌，其中荚果中内生真菌的分离率最高，且多样性指数也最高，而其他部位则差异不明显[15]。 2.3 内生真菌代谢产物多样性
目前，从植物内生真菌次级代谢产物中分离得到的化合物主要有聚酮类、生物碱类、萜类和甾类等，这些化合物表现出良好的抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒、杀虫等生物活性。内生真菌次生代谢产物具有不同的生物活性、多元的结构特性及多样的合成途径等特征。按照化学结构划分，药用植物内生真菌的主要代谢产物包括有机酸、挥发性物质、脂类和酶类、类固
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