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第六章 分子生物学技术

是以核酸、蛋白质等大分子为研究材料,研究其结构与功能,以空前的广度和深度揭示生命现象以及疾病的本质。在临床医学检验中,特别对遗传病和癌基因的检测已成为不可缺少的手段。

第一节 核酸的分离纯化技术

一、DNA的分离与纯化

根据DNA的结构及在细胞中分布的不同,分离提取的方法不同。 (一)大分子量DNA的分离与纯化

制备DNA的样品包括:生物组织、培养细胞、血样。在基因诊断中一般采用外周血白细胞。

制备DNA时,既需要去除蛋白质、脂类和糖类物质,又需要保证DNA的完整性。目前应用较广的方法有氯仿法;去污剂法;酚抽提法。

基本过程包括:

1. 细胞的破碎;(SDS,溶菌酶)

2. 去除蛋白质;(氯仿,苯酚和蛋白酶K) 3. 防止DNA降解;(核酸酶抑制剂,EDTA) 4. 沉淀DNA;(乙醇;异丙醇) 5. 消化RNA;(RNA酶)

6. 纯度测定;可采用紫外分光光度计测定提取物230nm,260nm,280nm的吸光度。A260 /A280≥1.8,A260 /A230≥2.0,表示提取物DNA的纯度好,A260 /A280比值太小,残留蛋白质太多,A260 /A230比值小,残留酚类有机杂质。

(二)质粒DNA的提取与纯化

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质粒是游离于细菌染色体之外,具有自行复制子的双链环状小分子DNA。在基因工程中常作为目的基因的载体。

质粒的提取方法很多,如碱裂解法,煮沸法,SDS法等,其碱裂解法是质粒的大量提取的常用方法。

基本原理:在pH12.0~12.6环境中,线状染色体DNA变性,而环状质粒DNA保持自然状态,调节pH至中性,增加盐浓度,使染色体DNA交联,形成不溶性网状结构,在SDS作用下,染色体DNA、蛋白质沉淀,离心,上清液中保留质粒DNA,抽提(酚,氯仿),乙醇沉淀。

二、RNA的分离纯化

RNA包括:rRNA、tRNA、mRNA。其中mRNA占总RNA1%~5%,含量少,但种类繁多,是分子生物学的主要研究对象之一。

(一)总RNA的提取

主要方法有异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法,盐酸胍-有机溶剂法,快速提取法等。

其中盐酸胍-有机溶剂法提取的RNA质量较好。

盐酸胍破碎组织细胞,并抑制RNA酶活性,氯仿去除蛋白质,乙醚沉淀RNA。

(二)mRNA的分离与纯化

利用真核细胞中mRNA 5′末端含有多聚腺苷酸序列,采用Oligo(dT)纤维素柱或Poly U琼脂糖柱的亲和层析。

第二节 DNA分析技术

DNA分析技术主要包括核酸纯化,基因分子克隆以及杂交分析。在医

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学研究领域多用于临床遗传疾病的基因诊断。

一、基因的分子克隆

基因是DNA分子中的一个片段,这一片段含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。(不仅是结构基因核苷酸序列,还有调控基因序列,内含子,5′,3′端非翻译序列)。

基因的分子克隆:从众多不同基因群体中分离出某一感兴趣的基因分子,通过无性繁殖(扩增),产生很多相同基因分子的集合。

(一)目的基因的制备

从染色体DNA中分离,通过mRNA合成cDNA和化学合成等方法制备。 1. 基因组DNA 将染色体DNA用限制性核酸内切酶切割成基因水平的许多片段,其中含有我们感兴趣的基因片段(目的基因),并与合适的载体进行体外重组,得到一系列重组DNA。这种由载体携带的所有基因组DNA的集合称为基因组文库(genomic DNA librarg)。基因组DNA文库就象图书馆库存万卷书一样,涵盖了基因组全部基因信息。

限制性核酸内切酶(简称为限制酶),能识别DNA的特异序列,并在识别位点或周围切割双链DNA的一类内切酶。

限制酶存在于细菌体内,目前发现的有1800多种,可分为三类,在重组DNA技术中常用的是Ⅱ类酶。它们识别的核苷酸序列都呈二重对称结构(回文结构),切割可产生3种不同末端的DNA产物。

平末端

5′粘末端

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3′粘末端 2. cDNA 以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(complementary DNA,cDNA),,再复制成双链cDNA片段,与载体进行体外重组,建立cDNA文库,与基因组DNA文库类似,由总mRNA制作的cDNA文库,包含了细胞全部mRNA信息。

3. 化学合成 如果已知某种基因的核苷酸序列或根据某种基因产物的氨基酸序列,推导出该多肽链编码基因的核苷酸序列,再利用DNA合成仪通过化学原理合成目的基因。

(二)基因扩增 主要方法有两种 1. 通过宿主细胞增殖而扩增

(1)载体 外源目的基因离开染色体是不能复制的,如果将目的基因连接到复制子上,目的基因则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制,这种复制子就是基因载体。目前已发展的基因载体有质粒、噬菌体、病毒DNA、人工染色体载体等。

质粒(plasmid) 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。它具有独立复制能力,并可在细胞分裂中与染色体一道分配到子细胞中,作为基因载体的质粒一般应具备以下特性:

① 具有能自主复制的复制子;

② 具有可供筛选的选择标记;营养缺陷型标记,抗菌素标记。 ③ 拥有多种限制酶的单一切点;以便外源基因的插入。 ④ 分子量小,且对外源基因有一定的容量;

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⑤ 松弛型复制,多拷贝。

70年代初用的是天然质粒,如今采用的质粒均由天然质粒经人工改建而成。如pBR322,PUC18,PUC19,PGEM系列。

λ噬菌体:为线状双链DNA病毒,寄主是大肠杆菌,与质粒相比,具有以下优点:

① 对外源基因容量比较大,可插入几kb到20kb的片段;

② 重组DNA可在体外被包裹成噬菌体颗粒,具有更高的感染宿主细

胞的能力。

③ 对寄主的选择面较质粒窄,因此,在基因工程操作的安全性上较

质粒有保证。

置换载体(取代载体) 一对限制酶切点 λ噬菌体载体 插入载体 单一酶切点

(2)体外制备DNA重组体:目的基因与载体在体外连接方式有多种。如定向克隆、粘性末端连接、平端连接、人工接头连接等。

定向克隆:利用两种不同的限制酶切割目的基因和载体,使载体的两端分别与目的基因的相应末端互补,当摸的基因插入载体时,只有一个方向可供选择。

(3)重组DNA导入宿主细胞 宿主细胞有原核细胞和真核细胞两类。

原核细胞 大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌等。

宿主细胞 大肠杆菌K-12衍生的安全宿主菌是常用的宿主细胞。

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第六章分子生物学技术是以核酸、蛋白质等大分子为研究材料,研究其结构与功能,以空前的广度和深度揭示生命现象以及疾病的本质。在临床医学检验中,特别对遗传病和癌基因的检测已成为不可缺少的手段。第一节核酸的分离纯化技术一、DNA的分离与纯化根据DNA的结构及在细胞中分布的不同,分离提取的方法不同。(一)大分子量DNA的分离与纯
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