蓝藻发酵生产微生物农药的影响因素研究
蔡健1，刘志2，王跃强3*，徐荣险3，周顺桂3
【摘 要】摘要：采用摇瓶发酵试验探讨了蓝藻为原料制备苏云金杆菌生物杀虫剂的可行性，并考察了不同培养条件（蓝藻含固率、种龄、接种量、初始pH、摇床转速、发酵温度）对苏云金杆菌生长增殖、产孢与产毒效果的影响。研究结果表明，无需任何预处理工序，Btk 130 菌株能在蓝藻为唯一原料的培养基中正常生长发育，并且产孢产毒。发酵48 h 后，芽孢产率达到86.7%，远高于常规培养基；生物毒效为282 IU·mL-1，与常规培养基相当。培养条件优化结果表明，在蓝藻含固率为2%、初始pH为7.0、接种物种龄为9 h、接种量为2%、培养温度为30 ℃、摇瓶转速为200 r·min-1 的条件下培养48 h，Btk 130 可达到较好的发酵效果，活菌数及抗热芽孢数可达7.32 CFU·mL-1 和6.38 CFU·mL-1，生物毒效为528 IU·mL-1。该研究不仅为蓝藻提供了高附加值的处置新途径，而且可显著降低生物杀虫剂的生产成本，具有广阔的应用前景。
【期刊名称】生态环境学报 【年(卷),期】2011(020)005 【总页数】5
【关键词】蓝藻；微生物农药；苏云金芽孢杆菌；培养条件
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）是一类能在代谢过程中产生芽孢和伴孢晶体的革兰氏阳性细菌，其制剂是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂，具有环境安全、选择性强、不易产生抗性等诸多优点[1-3]。目前Bt生物杀虫剂主流生产工艺为液体深层发酵，发酵原料为葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、黄豆
粉、玉米淀粉、花生饼粉、麦麸等，发酵原料昂贵、生产成本高是限制其推广的主要因素[4]。近年来，味精废水[5]、啤酒废水[6]、鸡舍垫料浸出液[7]、玉米浸泡液[8]等工农业废弃物被用于生产Bt 生物杀虫剂。然而繁琐昂贵的预处理、较差的稳定性限制了这些原料的应用。因此，如何采用低成本的发酵原料生产微生物杀虫剂是近来国内外的研究热点。
蓝藻是一类广泛存在于自然界中的光合自养型原核生物。当前，我国水体富营化严重，蓝藻水华频繁暴发，严重威胁我国水体生态环境。目前我国蓝藻治理技术以打捞为主。据统计，2008 年太湖蓝藻暴发时每天蓝藻打捞量高达数千吨，这些打捞上来的大量蓝藻如不妥善处理，容易通过渗漏、径流等造成二次面源污染。实际上，蓝藻中含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素、多种微量元素等[9-10]，是一种巨大的环境资源库，具有显著的资源化潜力。目前蓝藻资源化处置途径主要有生物质气化[11]、有机肥化[12]等，但都存在脱水复杂、利用率低的缺陷。因此，需要寻找新型高附加值蓝藻资源化技术。 本文针对蓝藻有机物丰富的特点，对蓝藻作为低成本发酵原料生产Bt 生物杀虫剂的可行性及影响因素进行了分析，期望在降低Bt 生物杀虫剂生产成本的同时，为蓝藻的资源化处置提供一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 菌种
供试菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki （简称Btk）130，本实验室保存。 1.2 培养基
LB固体培养基（g·L-1）：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 5.0，琼脂粉15.0，
pH 7.0。用于平板计数与斜面保存。
LB液体培养基：固体培养基成分中去除琼脂粉，用于制作接种物。 1.3 供试蓝藻
供试蓝藻采自太湖，置于4 ℃冰箱中保存。理化性质见表1。 1.4 摇瓶发酵试验与发酵液生物毒效测定
接种物制备：斜面培养基中移取一环活化的Btk 130 斜面菌苔，分别接种于100 mL LB 液体培养基（用500 mL锥形瓶盛装）中，于(30 ± 1) ℃和200 r·min-1 往复式摇床振荡培养9 h。预试验表明，此时它们处于对数生长期。 发酵方法：500 mL 锥形瓶内盛100 mL 蓝藻或LB 培养基，移取2%上述接种物，接种后按照要求控制不同的培养条件进行发酵（除特殊说明外，蓝藻含固率为2%，初始pH 为7.0，接种物培养时间为9 h,接种量为2%，培养温度(30 ± 1) ℃，摇床转速为200 r·min-1。每隔3 h 移取发酵液3 mL，测定pH、活菌数（VC）及抗热芽孢数（VS）。至48 h 发酵完成时用磷酸调节pH 至4.0 ~ 4.5，作为生物毒效测定样品。 1.5 分析方法
活菌数与抗热芽孢数：在无菌条件下，将发酵液进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液涂布平板，于30 ℃恒温培养16 ~ 18 h 后计活菌数；对于活芽孢数，需将适宜稀释度的菌液于80 ℃水浴处理15 min，然后进行平板涂布培养计数，每平板菌落数在30 ~ 300 内有效。芽孢与伴孢晶体采用苏云金芽胞杆菌菌体与晶体的区别染色法染色[13]，在光学显微镜下观察。
生物毒效：采用饲料喂食法，按照《中华人民共和国国家标准》GB/T 19567.3.2004，以小菜蛾幼虫作试虫，感染 48 h 后检查试虫死亡情况，计算
蓝藻发酵生产微生物农药的影响因素研究
