细胞冻存 细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告

细胞冻存

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一、实验原理

在低于-70℃的超低温条件下，由机体内部的生化反应极其缓慢，甚至终止，因此采用适当的方法将生物材料降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。 冷冻保存就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保存液的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其进行长期保存的过程。 水在低于零度的条件下→结冰→细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。最适冷冻速度：不同细胞的最适冷冻速度不同。标准冷冻的开始速度为－1至－2℃/min，当温度低于－25℃时，可加速，到－80℃时可直接加入液氮中（－196℃）。复苏细胞时则直接将细胞的冻存管放到40℃热水中迅速解冻。

二、实验目的

1、掌握无菌操作技术。

2、.掌握细胞冻存的一般方法与步骤。 3、掌握培养细胞的消化方法。

4、了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。

三、实验仪器、材料、试剂及用品

1、仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜 2、材料：人宫颈癌HeLa 细胞

3、试剂：胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素

4、用品：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯

四、实验步骤

1、穿好实验服，进入无菌室前穿鞋套、洗手。

2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置370C下预热。

3、无菌室及超净台紫外线照射，关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关，打开抽风机，用

75%酒精擦双手消毒，再用酒精棉擦拭桌面。

4、点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

5、配置5ml冻存液（DMEM 70%，FCS 20%，DMSO10%），即DMEM 3.85ml，FCS 0.65ml，DMSO0.5ml。 6、取待冻存的细胞用胰酶消化，靠近火焰倒胰酶，显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化。 7、加两滴管2mL冻存液，即全面吹打细胞瓶壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3×106个/mL左右。

8、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类，时间及冻存条件等）。 冻存管在40℃下存放30分钟，转放-20℃ 1.5～2小时, 再转入-700℃，4～12小时后即可转移到液氮内，注意进行登记。

五、实验结果

实验结果见下节课细胞复苏后可观察到。

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