特异性shRNA干扰人慢病毒载体抑制U251细胞株Chk1、
Chk2基因的表达
吴俊;赖国政;叶飞;雷霆
【期刊名称】《临床神经外科杂志》 【年(卷),期】2012(009)001
【摘要】目的 构建针对细胞周期检测点激酶1和2(Chk1和Chk2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,包装成慢病毒,建立稳定转染的细胞株,为探讨抑制Chk1和Chk2基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础.方法 根据GenBank数据库提供的Chk1和Chk2基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,命名为Chk1 - shRNA和Chk2-shRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为blank-shRNA.并与pLKO.1-TRC质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Nco Ⅰ酶切电泳,DNA测序鉴定,包装慢病毒.3组重组表达慢病毒载体转染胶质瘤细胞系U251,用嘌呤霉素筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株.逆转录酶-聚合酶连反应(RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测Chk1和Chk2的表达.结果 重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确.嘌呤霉素对U251细胞的筛选浓度为4ug/ml,筛选出稳定转染三种质粒的U251细胞,Chk1-shRNA和Chk2-shRNA组细胞各自Chk1和Chk2的mRNA和蛋白表达水平明显低于blank-shRNA组.结论 成功构建了针对Chk1和Chk2基因的shRNA慢病毒表达载体,转染后可抑制Chk1和Chk2基因的表达,为进一步研究Chk1和Chk2基因在脑胶质瘤细胞中的作
特异性shRNA干扰人慢病毒载体抑制U251细胞株Chk1、Chk2基因的表达
