第三节 红霉素的发酵、提炼工艺及过程
红霉素的产生菌是红色链霉菌(5zrfA‘帅yc‘‘fr)/jA雕M)。红霉京是多组分的抗生素,
其中红留素A为有效组分,红霉素B、红霉素c为杂物。国产红霉素中c为主要杂质。 红霉素c和A的结构极为相似,但红霉京c抗菌活性比A低很多,其毒性却是它的2 倍。由于两者在提炼过程难以分离,故要提高产品质量、提高产品的抗菌活性和降低毒性 (即减少成品中的红霉素C含量)。 一、菌种
我国20世纪60年代开始红霉素的工业生产,采用的产生菌是门2—102菌株,生产水 平不高,并易产生噬茵体污染。随后,选育了抗噬菌体的菌株,并使用自然分离、紫外线、氮
芥子气、硫酸二乙酯、亚硝酸、激光及快速中子处理等方法选育高产菌种。 随着菌种选育的发展,从控制红霉素生物合成的代谢路线进行定向筛选,得到抗乙琉氨酸
的菌株,并采用原生质体融合的方法获得高产优质的菌种。经生产实践,其红霉京A的含量
高,c的含量低,结合工艺控制条件的改进,发酵单位提高I叫左右点证了成品的质量。 二、发酵工艺及过程 (一)发酵工艺流程
沙土袍子羊至罕字十母瓶斜面袍子 (二)发酵工艺要点
I.种子 红霉素斜面袍子培养基是由玉米浆、淀粉、氯化钠、硫酸铵等组成。其中玉米
浆质量对袍子的外观及生产能力有直接影响,会出现“黑点”(即灰色焦状茵落)。有的生产 厂以蛋白陈代替玉米浆会使黑点减少甚至不出现,但其袍子量少。
袍子培养基消毒后必须快速冷却为妥,过长对袍子生长不利。温度37℃,湿度要求 50%左右,母瓶斜面培养9d,子瓶斜面培养7d。要求成熟的把子呈深米黄色,色泽新鲜、均
匀、无黑点,把子瓶背面有红色色素,并要求每瓶的袍子数不低于1亿个。将子瓶斜面把子 制成袍子悬浮液,用微孔接种的方式接人种子罐。
种子罐及繁殖罐的培养基由花生饼粉、蛋白陈、硫酸铵、淀粉、葡萄糖等组成。种子罐的
培养温度为35℃,培养时间65h左右;繁殖罐培养温度33℃,培养时间40h左右。均按移种
标准检查,符合要求进行移种。
2.培养基 发酵培养基成分由黄豆饼粉、玉米浆、淀粉、制钩糖、碳酸钙、硫酸铵、磷酸一
氢钾等组成。
(1)碳源:以葡萄糖为主(占80%一85%),其次是淀粉(占15%一25%)。为了降低成 本与节粮,生产上常用母液糖代替固体葡萄糖。
(2)氮源:以黄豆饼粉为主,其次是玉米浆和硫酸铵。中间补料有花生饼粉、蛋白陈、酵
母粉及氨水。黄豆饼粉因消毒时泡沫较多,故一、二级种子罐及后期补料用部分花生饼粉代 替,玉米桨质量对红霉素生物合成也有影响。有的工厂以玉米胚芽粉代替,因玉米胚芽粉
的合磷量低于玉米浆,因此配方中无机磷用量相应增加。 采用丰富培养基往往能提高发酵单位,但培养基丰富了,固形物增加使溶解氧随之下降,限
制了抗生家产量的近—步提高。采用基础原料液体化,即用蛋白酶水解各种饼粉,取滤液(酶解
液)代替固体饼粉进行发酵,6加上酶解液进行中间补料就使摇瓶发酥单位大幅度提高。 (3)前体:根据红霉家生物合成途径.红霉家c转为红雷素A需要甲基供体。发酵过 程加入丙酸或丙醇作为前体以提高红霉家A的产量。两酸作前体时其加入量、加入速度及 加入浓度控制不当易使菌丝自溶,甚至全罐损失。最好加入水稀释降低丙胶浓度,减慢加入 速度或用丙酸钠代替。丙醇作前体时,代谢较稳定,对pH影响小,发酵单位及成品的量都 比较高,但要注意防火安全。
国外介绍,菌种选育时用豆油作碳源可使产生菌利用脂肪酸的能力相应提高 培养基也用豆油作碳源,可不加前体,非但能提高单位,还可延长周期。 3.培养条件的控制
(1)通气和搅拌:发酵罐的通气量一般为1,o,8一1.2v/(V·min),增大空气流量和加 快搅拌转速会提高发酵单位,但必须加强补料的工艺控制,防止菌丝早衰自溶。
(2)温度:采用全程31℃培养,红色链霉菌对温度较敏感,若前期33℃培养,则菌丝生长
繁殖速度加快,40h新度即达最高峰,但衰老自溶亦快,发酵液容易下降。31℃培养菌丝生长
虽比33℃馒,48h新度方达最高峰,但衰老较馒,使新度下降速度减缓,转稀时间推迟。 (3)pH;整个发酵过程维持在6.6—7.2,菌丝生长良好,不自治,发酵单位稳定。如在
接种后24h内pH过低或偏高,则菌丝生长较馒,生物合成水平的差别也很显著,特别在发 酵前期,当pH为5.7—6.3时发酵终厂的单位仅为对照的一半。
曾用o.2m01儿磷酸盐缓冲液进行试验,将它加到72h的发酵液内,当PH为5.3时已
经生成的红霉家全部失效,菌丝自溶。当PH为6.3时红霉素部分失效,pH在6.7—6.9有
利于红霉家的生物合成。
(4)中间补料;发酵过程中还原糖控制在1.2%一1.6%范围内,每隔6h6D入葡萄糖,直
至故罐前12—18h停止加糖。有机氮源一般每B4r3—4次。根据发酵液新度的大小决定 补入量的多少,若新度低可增加补料量;反之,则减少补料量,甚至适量补水,故罐前24h停
止补料。前体一般在24h,当发酵液变浓,pH高于6.5时开始补入,每隔24hAR一次,全程
共加4至5次,总量为o.7%一o.8%。
(5)通氛:红霉素适宜后期通氨对提高发酵单位和成品质量均有好处,氨水加入方式以 滴加为佳。
(6)发酵液新度的控制:在一定的强度范围内,红霉素c含量与发酵液新度呈负相关的 关系。因此,适当提高发酵液新度能减少红霉素c组分的比例,从而保证成品质量。 .216.
发酵液熟度与搅拌功效、氮源补人量及培养温度有关。通过减慢搅拌转速、改变搅拌叶
型式、降低罐温、增加有机氮源补量,滴加氨水等能提高发酵液的教度。但熟度过高会影响 溶解氧的浓度,单位明显下降,所以必须因地制宜进行发酵工艺控制。
(7)泡沫与消沫:因发酵培养基有黄豆饼粉,故在培养基消毒及通争气时泡沫较多。一 般以植物油(豆油或菜油)做消沫剂,不宜一次多量加入。 三、提炼工艺及过程
红霉素的提炼方法有溶媒萃取法、离子交换法及大孔树脂吸附法: 要采用溶媒萃取法和大孔树脂吸附法。
链霉素的理化性质