pH敏感的荧光探针及在活细胞中的应用

pH敏感的荧光探针及在活细胞中的应用*

陈瑞希1,2,周宏福1,2,刘秀丽1,2*,曾绍群1,2

【摘 要】细胞内的pH是细胞内多种酶活性和生理活动的重要调节因素，准确、动态的监测细胞内pH变化对研究细胞内的活动至关重要。一些荧光小分子可以感应pH的变化，同时具有较高的灵敏度和特异性，对细胞损伤较小且标记操作简单，已逐渐发展成为一种监测细胞内pH变化的有效方法。本文主要介绍目前常用pH敏感的荧光探针及其在活细胞研究中的进展。 【期刊名称】激光生物学报 【年(卷),期】2016(025)006 【总页数】10

【关键词】pH敏感；荧光探针；小分子；活细胞 【文献来源】

https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_acta-laser-biology-

sinica_thesis/0201254573574.html

0 引言

细胞内pH值对维持细胞正常的活动，如细胞的增殖，凋亡[1]，自我吞噬[2]，离子运输[3]，内环境平衡[4]和酶的活性[5]至关重要。细胞内微环境内pH值改变，会导致细胞内功能紊乱，最终可能导致各种疾病(如阿兹海默症，中风，以及癌症)[6,7]。因此监测活细胞内pH变化对于探索细胞的新陈代谢以及更进一步的理解生理学和病理学的过程具有非常重要的意义。

目前检测细胞内pH值的方法有多种，如微电极法[8]，核磁共振法[9]，荧光探针法[10]以及荧光蛋白指示剂法[11]等。其中，荧光探针由于具有高灵敏度和特异性，操作简单，以及对细胞损伤较小等优点，引起研究者的极大关注。

生物学中常用的pH荧光探针可分为两大类：1)细胞质荧光探针，其工作环境的pH值为6.8～7.4；2)酸性细胞器荧光探针(如，溶酶体和核内体，其pH值得大约为4.5～6.0)。除了能够响应pH值变化以外，理想的pH荧光探针需具备一些基本条件：1)高选择性和灵敏度，对氢离子的选择性要比对其他离子的选择性高；2)要与系统相匹配的酸碱解离常数；3)优异的光稳定性，高荧光量子产率(高荧光量子产率可以降低染料的使用浓度，减弱对细胞的毒性)；4)与生物系统有兼容性(例如，水溶性和低的细胞毒性)。

荧光探针通常由荧光基团和识别单元构成。荧光基团相当于信号转换器，将识别的信息转化成光信号，转换的机理一般有：分子内电荷转移(Internal charge transfer,ICT)、光诱导电子转移(Photo-induced electron transfer,PET)以及荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)[12]等。识别单元可以识别特定部位并与其靶向结合。

本文对常用的小分子荧光探针监测细胞内pH的原理、特点与最新应用进行综述，并提出活细胞研究对pH监测技术的新要求，分析pH监测技术的发展趋势。

1 荧光素

荧光素是较为普遍的荧光试剂，它具有较高的摩尔吸光系数、优异的荧光量子产率、良好的水溶性、无细胞毒性、激发和发射光谱都在可见光区等优点[13]，因此，荧光素常用于生物标记实验。荧光素一般以两种形式存在：强荧光、开环的苯醌形式(碱性条件下)；非荧光、闭环的螺环内酰胺形式(酸性条件下)[14]。也有文献报道，在水溶液中可能会有两性离子形式的存在[15,16]。

荧光素类染料的荧光强度对于环境pH变化具有较强的依赖性，因此该类染料

大多可作为pH荧光探针。前面提到它有很多的优点，然而当它作为pH敏感的荧光探针也有一些缺点[17,18]。例如，荧光素可监测的pH范围在5.0～8.5，在监测生理环境的pH时，仍然会有很多闭环的非荧光形式存在，只有当pH值大于8.5时，荧光强度才能达到最大值。因此，研究者们尝试改进荧光素类pH探针，发展了如羧基荧光素，聚噻吩荧光素，磺酸荧光素和半甲萘酚荧光素等探针，希望能够降低探针的pKa，然而这些荧光素的衍生物并没有解决这个问题[19]。Ge et al.以氯原子取代芳香环上的氢原子，合成了氯代荧光素衍生物1～6(图2)，pKa降低在4.0～6.0范围内，这些探针在pH 6.8～7.4范围内荧光强度可以达到最大值，因此可以用来监测生理环境pH变化[20]。 荧光素类染料的另一个缺点是会从细胞中快速的渗漏，难以用来定量的监测细胞内pH值的变化[21]。Bradley et al.[22]将荧光素以共价键的形式与聚苯乙烯微粒连接，得到荧光微粒探针7(图2)。探针7不仅消除了荧光素从细胞中的渗漏，并且提高荧光素稳定性，同时保持了它的pH敏感性。该探针已用于实时的监测癌细胞中的pH值变化。

2 罗丹明

罗丹明(Rh)是一种细胞生物学中广泛应用的染料[23]。该类染料具有优良的光物理性质(例如，高摩尔吸光系数、良好的光稳定性、高荧光量子产率以及在可见光区吸收光谱和发射光谱范围较窄等)，以及良好的透膜性。罗丹明检测pH的机理与荧光素相似(图3)：也具有闭环和开环两种形式，螺环内酰胺形式是无色且非荧光的，而开环后的酰胺形式则显现出较强的荧光[24]；与荧光素不同的是，罗丹明类pH探针是在酸性条件下开环。

近些年设计合成的多种基于罗丹明的pH荧光探针，可选择性的响应较低的pH