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二、细胞内生物大分子的显示方法:
原理:利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征,通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。
DNA:福尔根(Feulgen)反应--紫红色 多糖类:PAS反应--黄色 脂肪:苏丹III--红色
蛋白质:米伦(Millon)--红色
1、金属沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀,而显示出酶活性。
2、Feulgen反应:醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸
3、四氧化锇:与不饱和脂肪酸反应成黑色, 脂肪滴
4、Millon(米伦)反应:氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的络氨酸残基反应,形成红色沉淀,(有色复合物) 蛋白质
5、联苯胺反应:过氧化酶分解H202。产生新生氧,后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝,进而变成棕色化合物。
6、脂溶染色法:借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 7、茚三酮反应:显示蛋白质 三、特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内蛋白质定位法:免疫荧光技术和免疫电镜技术
蛋白质体外定性法:免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析 (一)免疫荧光技术
根据免疫学原理,利用抗体同特定抗原专一结合,并标上标记荧光素,对抗原进行定位测定的技术。
快速、灵敏、有特异性,但其分辨率有限 。 (二)免疫电镜技术
能有效提高样品的分辨率,在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。
? 免疫铁蛋白技术
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小结
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小结 ? 免疫酶标技术
? 免疫胶体金技术
应用:通过对分泌蛋白的定位,可以确定某种蛋白的分泌动态;胞内酶的
研究;膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等
四、细胞内特异核酸序列的定位和定性
分子杂交技术:具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段,在适当
条件下,通过氢键结合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。
这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
? 原位杂交(in situ hybridization)。
用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针,后来又
发明了免疫探针法。
五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态
? 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合
成、更新、作用机理、作用部位等等。
? 原理:将放射性同位素标记的化合物导入生物体内,经过一段时间后,
制取切片,涂上卤化银乳胶,经放射性曝光,使乳胶感光,对细胞内生
物大分子进行定性、定位和半定量研究的一种细胞化学技术。
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? 一般用C和H标记。常用3H-TDR来显示DNA,用3H-UDR显示RNA;用
3H氨基酸研究蛋白质,用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。
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? C半衰期为5730年,H为12.5年。
六、定量细胞化学分析技术
1、流式细胞仪
? 用途:对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
? 可定量地测定某一细胞中的DNA,RNA或某一特异蛋白的含量,以及细胞
群体中上述成分含量不同的细胞的数量。特别是它还可将某一特异染色
的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来,以及将DNA含量不同的中期
染色体,甚至X或Y染色体的精子分离出来。
? 原理:包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴,形成包含单个细胞
的液滴,在激光束的照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检 欢迎下载
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小结 测,转换为电信号,送入计算机处理,输出统计结果,并可根据这些性质
分选出高纯度的细胞亚群,分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液,
所用仪器称为流式细胞仪(flow cytometer)。
2、显微分光光度测定技术
? 实质上是显微镜技术和分光光度技术的结合。它以物质分子的光吸收、
荧光发射和光反射特性作为测量基础,可以对细胞内的某些重要的生物
分子(如 DNA、RNA、蛋白质等)的含量进行定量测试,是组织化学和细
胞生物学中定量研究的必不可少的工具。
? 显微吸收光度法时一种光度测量的化学方法,它基于细胞内的蛋白质、
多糖、核酸、脂类和酶染颗粒能在不同等电点下电离出不同侧基,因而
造成对染料亲和力不同,应用不同的化学试剂染色,可使不同的细胞组
分染上不同的颜色,在显微镜下成为可见的结构。染料于组分的结合必
须是特异性的,即染料、细胞组分结合物的光吸收是遵循朗伯-比尔定律,
而且染色深浅与被染细胞组分之间呈化学剂量学关系,符合这两者关系
的样本就可应用吸收测量法,通过光检测器(可使光能变成电能)测量
有色化合物吸收单色光的量。
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养
细胞培养就是将动植物组织或细胞从机体取出,分散成单个细胞或直接以
单细胞 生物,给予必要的生长条件,让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增
殖。
(一)、动物细胞培养
? 原代培养(primary culture cell): 从机体取出后立即培养的细胞。
? 传代培养(subculture cell): 适应在培养条件下持续传代培养的细胞。
? 细胞系(cell line):通过纯系化或选择法从原代培养细胞中分离出来的细胞
群体。
? 细胞株(cell strain):从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的
细胞群。
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小结 细胞贴壁:分散的细胞悬液在培养瓶中很快(几十分钟货数小时内)就贴
附于瓶壁上的现象。
(二)、植物细胞培养
1. 原生质体培养:培养脱壁后的细胞,特点:
? ①比较容易摄取外来的遗传物质,如DNA;
? ②便于进行细胞融合,形成杂交细胞;
? ③适宜条件下可产生细胞壁,经诱导分化成完整植株。
2. 单倍体培养:通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。
(三)、非细胞体系
来源于细胞,而不具有完整的细胞结构,但包含了进行正常生物学反应所
需的物质(如供能系统和酶反应体系等)组成的体系即为非细胞体系(cell-free
system)。
用途:研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制
以及细胞核装配等。
二、细胞工程
(一)细胞融合与细胞杂交技术
通过培养和介导,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为
细胞融合(cell fusion)或细胞杂交。
? 同核融合细胞:基因型相同的细胞融合形成的杂交细胞。
? 异核融合细胞:基因型不同的细胞融合形成的杂交细胞。
? 自发融合:同种细胞在培养过程中自发合并的现象。
? 诱发融合:异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。
在自然界中细胞自发融合发生的机率很小,一般需要诱发融合。诱发融合
细胞的方法一般有以下几种:
诱发细胞融合的方法:
1、生物法:病毒促进细胞融合,其中仙台病毒(HVJ)是最早用于动物细
胞融合的融合剂。原理:病毒被膜具有凝聚细胞的能力,它一边黏连一个细胞
的表面,另一边黏连另一个细胞的表面,从而使两个细胞在病毒的作用下靠近
发生凝结,诱导细胞的融合。
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小结 2、化学法:主要包括盐类融合剂、聚乙二醇(PEG)、二甲亚砜(DMSO)、
甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。
其中聚乙二醇法是较常用的化学融合方法。其原理是PEG分子具有轻微的
负极性,与具有正极性基团的物质形成氢键,在原生质体之间形成分子桥,使
原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。
3、物理法:电融合法。其原理是改变原生质体质膜表面的电
荷和氧化还原电位发生改变,使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而
质膜开始连接,直到闭和成完整的膜形成融合体。
细胞融合的步骤
1、动物细胞的融合
(1)细胞准备。分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合
培养,后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。
(2)细胞融合,加促融因子于将行融合的细胞之中,诱导融合。
(3)杂种细胞选择。利用选择性培养基等,使亲本细胞死亡,而让杂种
细胞存活。
(4)杂种细胞克隆。对选出的杂种细胞进行克隆(选择与纯化),经过培
养,就能获得所需要的无性繁殖系。
2、植物细胞融合
植物细胞融合较动物细胞难些。首先,植物细胞外面有细胞壁,因此需要
先用纤维素酶去壁,形成原生质体后,才能进行细胞融合。其次,植物细胞融
合后形成的杂种细胞,经过培养有可能分化发育成植株,而动物细胞的杂种细
胞则缺乏此种能力。植物体细胞融合的过程大致包括:细胞分离,原生质体制
备,原生质体融合,杂种细胞筛选及其培养,然后再通过愈伤组织诱导分化出
根、茎、叶,最后长成完整的体细胞杂种植株。
细胞融合的意义是不仅打破了常规有性杂交育种的亲和性障碍,而且为实
现“超远缘杂交”提供了可能,把亲缘关系较远,甚至毫无亲缘关系的生物体细
胞融合在一起,扩大了遗传物质的重组范围,创造新细胞质杂种。
(二)单克隆抗体技术
1975年,科勒尔等人采用细胞融合技术,得到了杂交瘤细胞,由此开
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