β淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响

β淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的

影响

作者：韩笑峰 吕丽 葛汝丽 唐荣华

【摘要】 目的 探讨β

淀粉样蛋白(amyloid beta

peptide, Akappa B,

β)诱导小胶质细胞活化后κ轻链核因子(nuclear factorNF

κB)的表达及一氧化氮(NO)水平的变化。方法 Aβ干预纯化培养

的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定NO水平，免疫细胞化学方法研究NF

κB的表达。结果 500 nmol/L及1000 nmol/L

κB的表达增加（P

Aβ干预组细胞形态呈“阿米巴样”，细胞核内NF

＜0.05），培养基中NO浓度升高（P＜0.05）。结论 Aβ激活小胶质细胞NF

κB途径大量合成NO，可能参与阿尔茨海默病(Alzheimer’s

disease, AD)的致病过程。

【关键词】 β淀粉样蛋白 小胶质细胞 κ轻链核因子 一氧化氮 阿尔茨海默病

【Abstract】 Objective To study the morphological changes of microglial cell activated by amyloid betaexpression of nuclear factor

peptide, the

kappa B increased in nucleus and

the levels of nitric oxide in cultural medium. Methods Purified microglial cells were intervened by amyloid beta

peptide and

the morphological changes were observed . The cadmiumreduction method was used to determine the levels of nitric oxide

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in culture medium, immunocytochemical method to investigate changes of nuclear factor

kappa B. Results There were no

statistical significant differences between the experimental group of 100 nmol/L amyloid beta

peptide and the control group

(P＞0.05). In the experimental groups of 500 nmol/L and 1000 nmol/L amyloid beta

peptide, microglial cells were bigger, the

kappa B increased in nucleus and

expression of nuclear factor

the levels of nitric oxide were higher in culture medium than control group (P＜0.05).Conclusion The amyloid beta

peptide

could participate in the processes of Alzheimer’s disease by inducing microglial cells to excrete nitric oxide.

【Key words】 amyloid betanuclear factor

peptide，microglial cell，

kappa B，nitric oxide，Alzheimer’s disease

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)重要的病理特征之一是纤维状β

淀粉样蛋白(amyloid beta

peptide, Aβ)在神经细胞

外及脑血管壁沉积形成老年斑(senile plaques, SP)。大量研究表明，Aβ的沉积在AD发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitric oxide, NO)可能与Aβ的神经毒性有关。本研究用Aβ干预小胶质细胞，观测κ轻链核因子(nuclear factor

kappa B, NF

κB)的表达以及NO水平的变化，

探讨Aβ诱导小胶质细胞合成NO的机制。

1 材料和方法

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1.1 材料

1.1.1 动物：出生3 d内的Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（购自Hyclone公司），Aβ1

40、Aβ1

42（购自SIGMA公司），胰蛋白酶、TritonX

100

（购自Amresco公司），小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体（购自Serotec公司），兔抗NF

κB p65 多克隆抗体（购自SANTA CRUZ公司），抗

小鼠及抗兔SP试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自北京中山生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生Wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成0.5 mm3碎块，加入1 ml 0.125%胰蛋白酶室温消化，用100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的50 ml培养瓶中，置于37℃、含5%CO2、20%O2饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养7～9 d后，在37℃恒温摇床上以250 r/min振速摇动处理2.5 h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37℃培养1 h，弃未贴壁细胞，加新鲜培养基，培养5～7 d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原CD11 b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占90%以上即符合要求。

1.2.2 Aβ的“老化（aged）”：用无菌三蒸水将Ａβ稀释成 0.5×105 nmol/L，37℃孵育 1周，使其变为聚集状态的Ａβ［１］。

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