(完整版)04生物化学实验--醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

【目的】

1 ．掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的操作技术与原理。 2 ． 熟悉醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的临床意义。 【原理】

带电粒子在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象称为电泳

(Electrophoresis) 。蛋白质为两性电解质。在不同 PH 下，其带电情况不同。在等电点时，蛋白质为兼性离子，其实效电荷为零，不发生泳动。蛋白分子在 pH 小于其等电点的溶液中，呈碱式解离带正电向负极泳动。在 pH 大于其等电点溶液中， 呈酸式解离带负电，泳向正极。带电粒子在电场中的泳动速度常用迁移率 (Mobility) 来表示。它除与电场强度、溶液的性质等有关外，主要决定于分子颗粒的电荷量以及其分子的大小与形状等。电荷较多，分子较小的球状蛋白质泳动较快。

血清中的各种蛋白质的等电点均低于 7 ，故在 PH8.6 缓冲液中，均带负电荷。由于各种蛋白质的等电点不同，带电荷量不等，加之分子量不同，导致在电场中泳动速度不同，从而加以分离。清蛋白泳动最快，其次为 α 1 、α 2 、β及γ 球蛋白。将蛋白质固定染色后，洗去多余染料，可看到清晰的色带（图 3-3 ）。将各色带剪开，分别溶于碱性液中，可进行比色分析，计算出各种蛋白质的百分含量，或用吸光度计进行扫描定量。

图 3-3 正常人血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳示意图谱 【器材】

1 ．电泳仪 ( 稳压器、电泳槽 ) 2 ．分光光度计

3 ．点样器 (1.4× 1.8cm 的 X 光片 )

4 ．血清 ( 放置于载玻片上 ) 5 ．醋酸纤维薄膜 (2× 8cm ) 【试剂】

1 ． pH8.6 0.06M 巴比妥缓冲液

取巴比妥 1.62g ，巴比妥钠 12.38g ，用蒸馏水加热溶解冷却后加至 1000ml 。测试 pH 值，若 pH 偏离 8.6 ，可用 1mol/LHCl 或 NaOH 校正。 2 ．染色液 ( 任选其一 )

（ 1 ）氨基黑 10 B 1g ，三氯醋酸 13.4g ，磺柳酸 13.4g ，蒸馏水加至 1000ml 。

（ 2 ）丽春红 2 R 0.8g ，溶于 6% 三氯醋酸 100ml 中。 3 ．漂洗液

（ 1 ） 3% 冰醋酸溶液 ( 用于氨基黑染色 ) （ 2 ） 2.5% 醋酸溶液 ( 用于丽春红染色 ) ； 4 ．洗脱液

0.4mol/LNaOH 溶液。 5 ．透明液

冰醋酸 30ml ，无水乙醇 70ml ，醋酸乙酯 1ml 混匀。 【操作】 ? 准备

电泳槽内放适量的缓冲液于两侧。液槽间放一充满缓冲液的连通管，经过一定时间使两侧液面达到平衡后，取下连通管。

在电泳槽的两侧液槽内侧的支持板上分别用四层滤纸 ( 或纱布 ) 搭桥。即使其一端达到支持板上，另一端浸入缓冲液中。

在醋酸纤维薄膜 ( 2cm × 8cm ) 的无光泽面距一端 1.5cm 处，用铅笔画一线 ( 与此端平行 ) 。作为点样线。把膜放进缓冲液中浸泡数 h ，使膜完全浸透。 ? 点样

用点样器均匀蘸取血清后，垂直将血清点在薄膜的点样线上，使血清全部渗入膜内。 ? 电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上。放置时点样面向下，点样端置于阴极侧。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，膜条要拉展。约平衡 5min 后通电。电压为 6V/cm 长 ( 长指膜条与缓种液面上的滤纸桥总长度 ) ，电流为 0.4~0.8mA/cm 宽，夏季通电约 45min ，冬季通电约 1h 。关闭电源。 ? 染色与漂洗

通电毕，用无齿小镊子将膜取出并水平移于染色液中固定染色， 2~5min 后取出立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景无色为止。用滤纸吸干多余的漂洗液。此时可见界限清晰的五条区带 ( 氨基黑染色为蓝黑色区带，丽春红染色为红色区带 ) 。最前面的一条为清蛋白带。如右图： ? 定量分析

取试管 6 支，编号，分别用吸量管吸取 0.4mol/L NaOHml 。剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使颜色洗出。约半小时后用分光光度计进行比色。氨基黑 10B 染色者，选用 620nm 波长，丽春红染色者选 580nm 波长。用空白管调 “0” ，分别读取各管吸光度值之和作为 100% ，求出每管吸光度值占总吸光度值的百分数，即该种蛋白质占血清蛋白的百分比含量。

另外，如用吸光度计扫描，需要先使膜透明化。可把染色后干燥的薄膜放透明液中 10~20min ，取出贴到玻璃板上放干。得到透明薄膜，可用吸光度扫描计描记出电泳曲线。亦可据此算出各蛋白百分数。正常血清血清蛋白的等电点、分子量及含量见表 3-1 。

表 3-1 正常血清蛋白的等电点、分子量及含量

血清蛋白质 清蛋白 α 1 – 球蛋白 α 2 – 球蛋白 β – 球蛋白 γ – 球蛋白 等电点 4 .64 5 .06 5 .06 5 .12 6 .85~7 .3 分子量 69000 20000 300000 90000–120000 156000–950000 占总蛋白（ % ） 57– 72 2– 5 4– 9 6.5– 12 12– 20 血清蛋白电泳结果有一定临床意义。肝硬化清蛋白明显降低。而 γ – 球蛋白可增高 2~3 倍。肾病综合症和慢性肾小球肾炎时可见到清蛋白降低， α 2 和 β 球蛋白增高。从电泳谱上亦可查出某些异常，例如多发性骨髓瘤病人血清，有时在 β 和 γ 球蛋白之间出现巨球蛋白。原发性肝癌病人血清在清蛋白与 α 1 球蛋白之间可见到甲胎蛋白。 【注意事项】

? 点样线要细窄、均匀、集中，量不宜过多，保持薄膜清洁。 ? 盐桥及醋纤膜要放置平整，保证电场均匀。

? 严格控制好电流，电压与电泳时间。电压高，电流强度大，则电泳快，电泳时间虽可缩短，但其产热多，薄膜上水分蒸发也多，严重时会使图谱短而不清晰；相反，电流、电压过低，电泳所需时间延长，由于样品的扩散，也不能获得良好的图谱。一般气温低时，可用较大的电流、电压；气温高时，则宜用较低的电流、电压。 【思考题】

1 ．为什么薄膜的点样面朝下，点样端置于阴极？ 2 ．用醋酸纤维薄膜作为电泳的支持物有何优点？