凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测
1 实验目的
1.1 通过测定凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测，研究缺糖对细胞增殖抑制作用的机制（引起细胞凋亡或坏死）。
1.2 掌握免疫组织化学法的原理。
2 实验原理
2.1 免疫细胞化学和亲和组织化学
免疫细胞化学（免疫组化）将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，从而对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。
2.2 凋亡相关基因—Bax
Bax是Bcl-2家族成员。凋亡信号能激活Bax，使Bax蛋白从胞浆移位到线粒体膜上。随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放Cytc，引起细胞凋亡。
3.3 Bax表达产物差异检测
本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。
3 实验材料
仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜。 材料：培养细胞。
试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3％H2O2-PBS。
4 实验步骤
培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）— PBS洗，5min X 3次 (轻轻地洗涤) — 甲醇固定10min — PBS洗，5min X 3次 — 加入封闭液（1:10） 25μl，37℃，30min — 加一抗（1:300）25μl，37℃，1h — PBS洗，5min X 3次 — 加二抗25μl，37℃，1h — PBS洗，5min X 3次 — 加0.3％ H2O2-PBS，37℃，30min — PBS洗，5min X 3次 — SABC工作液20-30μl，37℃，1h — PBS洗，5min X 3次 —DAB显色，观察结果。
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5 实验结果
正常组的细胞形态饱满，胞质透明，基本不着色，核形态规则，为圆形或椭圆形。 损伤组中，部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。
损伤恢复组中，少部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。
免疫组化显示，Bax构象蛋白在正常组细胞中几乎没有表达，而在损伤组和损伤恢复组中均有表达，其中损伤恢复组的Bax构象蛋白表达量高于损伤组（图1）。
A B
图1 免疫细胞化学法检测Bax蛋白的表达
C
A：正常组的CHL细胞；B：损伤组的CHL细胞；C：损伤恢复组的CHL细胞
6 讨论
6.1 Bax可以被凋亡信号激活，从胞浆移位到线粒体膜上，随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放Cytc，引起细胞凋亡。Bax促进凋亡的机理主要是：①线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破坏；②细胞氧化还原作用改变；③线粒体中的凋亡相关Apaf-1 释放出来，与细胞色素c相互作用，激活Caspase信号转导途径。Bax构象蛋白含量可以作为评价细胞凋亡的指标。
本实验用免疫组化法检测了正常组、损伤组、损伤恢复组的Bax构象蛋白表达变化，结果显示，Bax构象蛋白阳性表达量：损伤组>损伤恢复组>正常组。由此可知，①缺糖对CHL细胞增殖的抑制作用是通过促进细胞凋亡实现的；②细胞凋亡程度：损伤组>损伤恢复组>正常组。
6.2 本实验中，损伤组细胞的Bax构象蛋白表达量高于损伤恢复组，原因可能是损伤时间（5h）不长，线粒体和细胞膜的正常功能未完全丧失，糖的重新加入一方面为细胞提供了能量来源，另一方面可以增强细胞质和线粒体内的应激蛋白（如grp75）的表达，而grp75的上调表达可以起到保护蛋白质，协助蛋白（特别是线粒体蛋白）转运，提高细胞对应激反
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应耐受性的作用，从而延缓细胞凋亡。
当缺糖时间过长时，由于线粒体和细胞膜的正常功能已基本丧失，糖的重新加入可能不会延缓细胞的凋亡进程，甚至可能通过引起ROS的升高，造成缺糖恢复组的凋亡程度高于缺糖组（可以设计实验进行探索）。
6.3 正常组中，细胞密度较高区域的细胞呈现Bax构象蛋白高表达，原因可能是接种细胞过多以致部分区域细胞发生凋亡。
6.4 几种试剂的作用
6.4.1 封闭液可以封闭非特异性位点，从而保证抗原抗体间的特异性结合。
6.4.2 0.3％ H2O2-PBS（甲醇）可以消除内源性过氧化物酶活性作用，从而消除其对SABC-DAB显色的影响。
6.4.3 SABC 是链酶亲和素——生物素——过氧化物酶复合，起到信号放大作用。 6.5 检测细胞凋亡的其他方法
凋亡相关蛋白（Bax, Bcl-2, Caspase-3、8、9等）表达变化的检测除了用免疫组化法外，还可以用Western blot法。除此以外，还可以利用透射电镜、荧光显微镜、DNA ladder、流式细胞仪检测细胞凋亡 。
6.6 后续实验设计
本实验检测到了Bax构象蛋白在损伤组和损伤恢复组细胞中的表达，可以设计后续实验，研究缺糖诱导细胞凋亡的信号通路。
核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，是由p50和p65（Rel-A）两个亚单位构成的异源二聚体，p50 是与DNA 结合的部分，p65 是与抑制蛋白IκB（Inhibitors of Kappa B）结合的部分。众多研究结果指出，核转录因子NF-κB在抑制细胞凋亡中起到重要作用。NF-κB有多种功能，其一就是增强Bcl-2 表达和抑制Bax表达。Bax/Bcl-2 比值的升高可以激活Caspase-3，而Caspase-3是细胞凋亡的执行者，它可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡。
缺糖诱导CHL细胞凋亡的机制可能与抑制核转录因子NF-κB活化，导致Bax/Bcl-2 比值的上调，继而激活Caspase-3有关。
故可用Western blot法检测凋亡前后NF-κB(p65)和Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达变化，从而验证上述假设。
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细胞实验报告
