等浓度洗脱：
开机步骤：
1.配有机相，体积≥200ml（空瓶子先装满肥皂水超声10min，再用自来水冲洗10次，蒸馏水洗4次），砂滤（用有机膜，光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸），室温超声10min。开电源总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关。 2.开purge阀，把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中，purge，绿灯闪后关purge阀，把废液瓶放地上。
3.打开软件，系统设置：确认添加LC-15C(A)，确认柱温箱为（室温较低35℃，室温较高30℃）
简单设置：LC时间：60min 波长：215nm
模式：等浓度洗脱
总流速：0.6ml/min——下载（有机相较少时改流速为0.5ml/min）
点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。
（若压力线与基线相差过大，则点击显示设置，修改强度范围，再点击检测器零点，快走平时调回原来的强度范围）
4.基线走完，不关泵开关，点击单次运行，改文件名和存储位置。
5.纯甲醇洗针三次，每次＞60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进样量≥40ul。若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸中再进样。
6.进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，再掰下阀，则仪器自动开始走线。
关机步骤：
方法一：
1.测样结束，点击停止，关泵开关，待压力降为0，开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中，purge，绿灯闪后关purge阀。 2.简单设置：总流速：1.0ml/min——下载 点泵开关，洗脱柱子30min
3.在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次＞60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次≥60ul，将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min，把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次，等待洗脱柱子完成。（纯甲醇当天用不完的应丢弃）
4.黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关LC-15C
开关，关SPD-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。 5.洗废液瓶、废液缸。 方法二：
1.测样结束，关泵开关，待压力降为0，开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中， purge，绿灯闪后关purge阀。 2.简单设置：总流速：1.0ml/min——下载 3.关软件，关SPD-15C开关
左侧控制面板点击“PUMP”，洗针步骤同上
4. 30min洗柱结束后，摁“PUMP”关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关LC-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。 5.洗废液瓶、废液缸。 方法三：
1. 测样结束，关泵开关：左侧控制面板点击“PUMP”，将阀往上推
2. 调流速：Func——连续摁直到出现“system change”，1为local，enter确定，摁CE退回
到主界面。再次摁Func使主界面光标移动，数字键盘输入1.0ml/min，enter确定。 3. 待压力降为0，开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中，purge，
绿灯闪后关purge阀。
4. 摁 PUMP洗脱柱子30分钟，洗针步骤同上。
5. 30min洗柱结束后，摁“PUMP”关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关LC-15C开关，
关柱温箱开关，关机，关电源总开关。 6. 洗废液瓶、废液缸。
二元梯度洗脱：
开机步骤：
1.配有机相、纯水相，体积≥200ml（空瓶子先装满肥皂水超声10min，再用自来水冲洗10次，蒸馏水洗4次），砂滤（用水膜/有机膜，光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸），室温超声10min。开电源总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关，LC-15C开关。
2.把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge阀，把B管从纯甲醇中取出，同样靠壁几秒后放入纯水相中，开purge阀，purge，绿灯闪
后关purge阀。
3.打开软件，系统设置：确认添加LC-15C(A)，LC-15C(B)，确认柱温箱为（室温较低35℃，室温较高30℃）
简单设置：LC时间：60min 波长：215nm
走基线时前20分钟：
模式：等浓度洗脱 泵A流速：0.6ml/min 泵B流速：0.4ml/min——下载
走基线后40分钟：
模式：二元梯度洗脱 总流速：0.6ml/min
泵B浓度：85% ——下载（有机相较少时改流速为0.5ml/min）
点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。
4.LC时间设置：设置需要的浓度梯度，注意前后浓度不一致时需平衡20min 5.基线走完，点击单次运行，改文件名和存储位置。
6.纯甲醇洗针三次，每次＞60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进样量≥40ul。若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸中再进样。
7.进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，再掰下阀，则仪器自动开始走线。
关机步骤：
1.测样结束，关泵开关，待压力降为0，将A管从有机相中取出，放回纯甲醇中，B管从纯水相中拿出，放回纯甲醇中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge阀。 2.简单设置：模式：等浓度洗脱
总流速：1.0ml/min 泵A浓度：0.4ml/min 泵B浓度：0.6ml/min——下载
点泵开关，洗脱柱子30min
3.在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次＞60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次≥60ul，将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min，把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次，等待洗脱柱子完成。（纯甲醇当天用不完的应丢弃）
4.黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关LC-15C、LC-15C开关，关SPD-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。 5.洗废液瓶、废液缸。 注：
甲醇截止波长：210nm 乙醇截止波长：190nm
当样品的最大吸收波长＞220nm，用甲醇作为有机相（便宜） ＜220nm，用乙腈作为有机相
对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。
*当有机相比例减小10%时，极性变小，洗脱时间变长，应相应调长20min的LC停止时间和结束时间。
当降低检测器波长时（降到215nm），流动相从纯甲醇变为85%甲醇，走基线会出现鬼峰，且很难走平
当流动相为80%甲醇时，出峰时间为22.5min，超过LC停止时间，则改变流动相为85%甲醇，提前出峰时间
本实验室所用液相型号： 柱型：C18 化学键合相色谱 紫外检测器
当点过单次运行，显示加入批处理队列时，点击“STOP”停止批处理队列，即可进样。
明明有杂质却检测不出峰？
1. 检测器是紫外检测器，而杂质可能几乎没有紫外吸收
2. 有杂质的表现是压力线上移或者峰变形，而图显示峰变形，因此推测是较强的吸收峰将
杂质包在里面而使得峰变形了
为什么停止了单次运行后还能出峰但在再解析的图上却看不到停止之后这个峰？
因为仪器只记录了停止运行前的数据，但之后检测器还是会进行检测，只是不再保存该数据。
现象类型
可能的原因
正方向：污染物积累/洗脱
负方向（梯度型）：流动相“A”溶剂有吸收 正方向（梯度型）：流动相“B”有吸收 正方向（梯度型）：流动相“B”有吸收 随机性：温度变化 随机性：温度变化 波浪形：室内温度变化 系统没有平衡 检测池中有气泡
保护柱被污染
基线漂移
色谱柱被污染
检测器污染 流动相污染 检测器灯老化
使用梯度方法 系统漏液 流动相混合不准确
试剂瓶中过滤头堵塞 检测器灯老化 随机性：污染物积累
基线噪声大
连续性：检测器灯故障 偶然性：外界电干扰 尖峰：检测器气泡
解决方法
清洗色谱柱，净化样品，用
将柱和管路绝缘保温
用不吸光度或HPLC级试
用不吸光或用更高的紫外波
用不吸光或HPLC级溶剂
将柱和管路使用恒温柱箱 监测和控制室温
以10倍柱体积流动相平衡
对流动相进行脱气，然后将的坐高限压力 更换保护柱
使用合适的溶剂对色谱柱进根据说明书清洗检测池
使用新配制的HPLC级溶一般当灯的使用时间超过
使用更纯的溶剂或者更高的
检查或更换漏液管路或零件
使用过程中，确保比例阀切
过滤头用水超声，然后用甲
更换灯，特别是当灯的使用
冲洗柱，净化样品，使用
更换紫外灯（寿命1000h）
使用液相色谱专用电源稳压
流动相脱气或反压调节器
高效液相色谱HPLC操作步骤及问题集锦
