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Figure 2. Photosynthetic parameters of E. ulmoides leaves at different levels of mechanical damage. Note: The error bars in-dicate standard deviation (the experiment was repeated 3 times), and the different letters (a, b, c) indicated above the error bars indicate statistically significant differences at p < 0.05 (Duncan test)
图2. 不同程度机械损伤处理下杜仲叶片上、中、下叶位的光合参数情况。注：误差线表示标准偏差(实验进行了3次重复)，而误差线上方指示的不同字母(a，b，c)表示在p < 0.05时具有统计学显着性差异(Duncan检验)
3.2. 不同机械损伤程度处理对杜仲叶片酚类物质的影响
使用LC-MS共得到21种次级代谢物，包括苯丙氨酸和绿原酸，对香豆酸等酚类化合物。经过分层聚类分析可以看出，三种处理下杜仲样品的酚类化合物积累的模式大致分成四个聚类，说明经过不同程度机械损伤处理的杜仲次生代谢产物含量之间既存在相似性又存在一定的差异性。从图3可以看出，对
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羟基肉桂酸，对羟基苯甲酸，对香豆酸和山奈酚这四种代谢物在机械损伤处理下，所有组织部位中都有所增加。从热图可以看出大多数酚类代谢物主要在叶片中含量较高，且叶位的不同对其含量没有显著变化。在机械损伤处理下，绿原酸，杨梅苷，柚皮素，槲皮素-3-O-鼠李糖苷，芦丁和香草酸这六种酚类化合物的含量在杜仲叶片中有所积累。而丁香酸，脱落酸，咖啡酸，木犀草素，苯丙氨酸，矮牵牛素，金雀异黄素的变化趋势主要体现在根部，这些化合物含量在进行机械损伤处理的植株根部比对照有明显的增加。相对于其他化合物，阿魏酸、儿茶素、槲皮素在机械损伤条件下没有上调积累。
Figure 3. Effects of mechanical damage treatment on E. ulmoides. Note: C (control); M (mild mechanical injury); S (severe mechanical injury); l1 (upper leaf); l2 (median leaf); l3 (lower leaf); s (stem); r (root)
图3. 不同程度机械损伤处理对杜仲酚类物质的影响。注：C (对照)；M (轻度机械损伤)；S (重度机械损伤)；l1 (上位叶)；l2 (中位叶)；l3 (下位叶)；s (茎)；r (根)
经过显著性差异分析，我们可以看出图4中的8种酚类化合物在杜仲叶片中特异性响应机械损伤。其中对香豆酸、杨梅苷和山奈酚在轻度机械损伤条件下，在杜仲茎中也有少量积累。芦丁主要积极响应于轻度机械损伤，而其他酚类化合物在轻度机械损伤情况下没有显著增加，重度胁迫时开始积累。表明机械损伤可以提高杜仲植株的多种酚类化合物含量，尤其在叶片中。
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Figure 4. Variation trend of phenolic compounds that specifically respond to E. ulmoides leaves under different degrees of mechanical damage. Note: The error bars indicate standard deviation (the experiment was repeated 3 times), and the different letters (a, b, c) indicated above the error bars indicate statistically significant differences at p < 0.05 (Duncan test)
图4. 不同程度机械损伤处理下特异性响应杜仲叶片的酚类化合物变化趋势。注：误差线表示标准偏差(实验进行了3次重复)，而误差线上方指示的不同字母(a，b，c)表示在p < 0.05时具有统计学显着性差异(Duncan检验)
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4. 结果与讨论
光合作用是植物体内唯一的碳素来源，植物在适应不同生长环境时表现出不同的光合生理机能，光合参数是植物适应环境的直接表现[23]。较强的光合能力是经济产量的物质基础，也是植物积累有效物质的前提[24]。光合作用受到植物所在处外界环境变化或自身遭受胁迫的影响，因此植物在非生物胁迫后是否处于正常生长状态，可以通过光合参数情况进行评价[25]。光合速率(Pn)是植物重要的光合参数之一，在光合作用的过程中，可以直接反应植物在目前光环境中有机物合成情况。由于重度机械损伤情况下叶片气孔的关闭或减小严重阻碍环境CO2从叶片外向叶绿体内的羧化部位有效扩散，导致胞间CO2浓度(Ci)下降，已经引起中位叶和下位叶中净光合速率显著降低。而轻度机械对杜仲植株的光合作用影响不大，说明植物的生理特性还没有遭到更多破坏。杜仲叶的产量、药用成分含量以及质量是叶用杜仲选育的重要指标，净光合速率作为重要光合参数是衡量植物生长状态的有效因素[26]。光合特性的研究为杜仲对机械损伤应激提供了一定的生理参考依据。
在植物栽培繁育的过程中，昆虫啃食或较大型食草动物的危害以及人工进行的嫁接、环剥、剪叶等技术都会给正常生长的植物造成机械损伤。植物进化出多种机制来保护自己免受广泛的攻击。例如，在伤口修复过程中包括局部和全身位置，以防止感染的渗透。植物受到昆虫取食或损伤后，不仅被害部位产生防御反应，且在机体其他未被损害部位也发生系统变化[27]。化合物的生物合成是一种常见的防御策略，主要是由干扰因子引发的次生代谢产物。次生代谢物被认为是专门为适应环境压力而进行的生物合成。它们是由代谢途径产生的，对激素、应激和生长等调节的不同条件表现出不同的趋向性[28]。植物通过次生代谢途径产生大量挥发性有机化合物、单宁以及酚酸等重要的化学防御物质，增加植物的防御能力，对外界刺激做出响应[29]。具体化学防御物质主要通过苯丙氨酸合成反式肉桂酸参与苯丙烷代谢，继续合成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等一系列中间产物，这些有机酸转化为较为复杂的香豆素、绿原酸，CoA酯等，再进一步合成为下游的类黄酮、木质素等次生代谢产物[30]。这些次生物质在植物抗逆境、抗病害上有非常重要的作用[31]。在之前的研究中表明，轻度机械损伤可以诱导冷蒿枝叶和根系中PPO、PAL和抗氧化酶迅速做出响应，活性显著升高；随着机械损伤强度增加，冷蒿枝叶咖啡酸、丁香酸、阿魏酸和肉桂酸含量显著增加，且叶片中酚类化合物含量显著高于根部[32]。在本研究结果中,杜仲植株机械损伤后，诱导体内21种酚类化合物发生变化，尤其在叶片中绿原酸、香草酸、对香豆酸、柚皮素、芦丁、槲皮素-3-O鼠李糖苷、杨梅苷、山奈酚这8种酚类化合物的含量迅速增加，特异性响应叶片的机械损伤处理，说明这几种酚类物质可能是杜仲叶片的重要防御物质。绿原酸是杜仲主要的有效活性成分之一，具有神经保护作用等显著功效，2005 年《中国药典》将绿原酸含量作为杜仲叶生药的主要有效活性成分和质量控制的标准。机械损伤引起杜仲叶片中绿原酸的特异性增加，对杜仲叶品药用价值的提高具有重要意义。
5. 结论
本研究分析了不同程度机械损伤处理对茶用杜仲叶片光合生理作用的影响，以及酚类代谢物的积极调控，揭示了杜仲叶片应激机械损伤的防御反应特点。轻度机械损伤不影响杜仲的正常光合作用，重度机械损伤对其有一定的影响。机械损伤下多种酚类化合物在杜仲不同组织部位中积累模式发生显著改变。绿原酸、香草酸等酚类化合物可能是杜仲叶片应对机械损伤的重要防御物质。这将为培育高质量茶用杜仲叶片，积累叶片活性成分，提高杜仲茶保健价值提供科学合理的理论依据。
基金项目
林业公益性行业科研专项(201504701-2)。
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机械损伤对茶用杜仲光合作用以及酚类物质影响的研究
