乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe) 6、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）
N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
三、甲醇酵母表达系统
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子：指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母，如：毕赤酵母、 汉森酵母、假丝酵母
甲醇氧化酶启动子： A、目前已发现的、最强的真核启
B、严谨调控型启动子：
AOX1：甲醇诱导，葡萄糖阻遏，甘油脱阻遏 MOX：甲醇诱导，葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏 2、甲醇酵母表达系统的优缺点 A、表达水平高（最高水平的系统）
B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化
C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单
G、不能满足结构要求严格的糖基化 3、甲醇酵母二大宿主系统主要特点
项目 毕赤酵母 汉逊酵母 最适温度 30℃ 37℃ 最适pH值 4.5 4.5 甘油阻遏 是 否 糖基化 部分过度 较正常 高密度发酵 100g/L 100g/L
选择标记 his4、G418、 Zeocin、Cu++ leu2、 his3 、ura3、 G418
4、毕赤酵母系统表达载体与整合模式
毕赤酵母系统表达载体与整合模式整合位点整合位点整合方式整合方式线性化位点线性化位点5OX1 5’’AAOX1 插入插入SacISacIAOX1 AOX1 取代（置换）取代（置换）BglotBglIIII或或NNotIIHIHIS4 S4 插入插入SalSalII或或StStuIuII 甲醇酵母(毕赤）工程菌构建、筛选与鉴定选择宿主株与载体构建表达载体转化宿主菌转化子一级筛选（His4+转化子筛选）二级筛选（多拷贝整合子筛选）PCR鉴定甲醇表型筛选/鉴定表达试验甘油种
5、多拷贝整合重组子筛选
必要性： 目的基因表达盒的多拷贝整合是高效表达的基础，但多拷贝整合是低概率事件（1-10%） G418抗性筛选：
表达载体引入卡拉霉素基因（Kanamycin）作二级筛选标记，从His4+转化子中筛选高G418抗性转化子，抗性越高整合拷贝数越高。
杂交筛选：菌落原位或Dot-Blotting杂交筛选
6、His+转化子甲醇表型筛选
必要性： A、不同目的基因的表达偏爱不同甲醇表型
B、工程菌表达诱导条件的优化需要依据甲醇表型 C、限切酶线性化方式诱导靶向整合（下表），但即使非AOX1取代型整合方式，也有可能因同源重组而破坏AOX1基因，产生MutS表型。 线性化位点 （限切位点） SalI or StuI SacI NotI or BglII 整合事件 （位点） 插入，his4 插入，5’AOX1 取代，AOX1 GS115株 （AOX1野生） His+Mut+ His+Mut+ His+Muts KM71株 （AOX1缺失） His+Muts His+Muts His+Mut+Arg-
7、转化子PCR鉴定 必要性：
证明外源基因确实整合在宿主基因组DNA，并排除意外丢失目的基因（机理不明）的 His+表型转化子。
PCR鉴定：以GS115的His+转化子为例 模板：转化子基因组DNA 引物：Primer 5’：来自5’AOX1；Primer3’：TT（3’AOX1） 产物：a.目的基因（AOX1缺失，Muts 型转化子） b.目的基因+完整AOX1基因（Mut+型转化子）
高密度发酵工艺流程与碳源操作
种子液制BMGY，至对数期，16-24hr，OD600=2-6 基础培养 4%甘油+无机盐培养基，至甘油耗尽，18-24hr 甘油流加以50%甘油限制性流加，增加细胞密度，4hr，180-220g/L 甲醇流加期 以100%甲醇限制性流加，诱导表达，增加细胞密度，48-68hr，350-450g/L 收罐（固液分离）
第六章 昆虫基因工程
1、DNA转座子的类型
插入序列(IS)： 最简单的转座子称为插入序列(Insertion sequence，IS)。 IS家族有很多成员，它们的结构相似
特征：两端都有短5-9bp的正向重复序列（direct repeats, DR）（靶序列），略长15-25bp的反向重复序列（inverted repeats, IR）1kb左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶。 复合转座子（composite transposon）
复合转座子是由两个重复序列夹着一个或多个结构基因如某些抗药性基因和其它基因组成。存在于R因子及其它质粒中。复合转座子两端的组件由IS和类IS组成。 2、DNA转座的一般模式
转座可被分为复制性和非复制性两大类。
在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA类转座主要是这种形式。
在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。 3、果蝇转座元件
Copia 反转座子；FB 家族；★P 元件 P 因子
P因子全长2 907 bp，两端有31bp的反向重复序列。4个编码区、3个内含子。
体细胞中，只有内含子1、2被顺利切除，产生前3个外显子的功能型 mRNA，被翻译成66KD的转座阻遏蛋白——一种转座活性的抑制因子。
生殖细胞中，内含子3被切除，产生的成熟mRNA包括全部4个外显子并被翻译成87KD的转座酶，才能导致P因子转座和配子不育。
P元件介导的果蝇杂交不育的原因：P元件在染色体ω遗传位点的插入往往会导致不育，这是由于很多的P因子发生转座，造成插入突变。含有P因子的雌果蝇与无论是否带有P因子的雄果蝇杂交，由于P细胞型的存在抑制了转座酶的合成或激活，表现出正常的生育能力。但当雌果蝇为M型时，在卵中无阻遏物，这样导致了来自雄果蝇生殖细胞中的P因子转录为转座酶。 4、杆状病毒
1）杆状病毒科分为包涵体杆状病毒和非包涵体杆状病毒2）宿主仅限于无脊椎动物3）杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子4）杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录5）双相生活史
第一时相：时间：感染后的0-24小时。结果：产生大量的BV，出芽释放，在虫体内传播
第二时相：时间：感染24小时以后。结果：形成大量的ODV，被多角体蛋白包裹，最终形成多角体，经口感染其它宿主。
5、杆状病毒高效表达系统
1) 病毒基因组较大,可以插入相当大的外源DNA片段2)常采用多角体蛋白基因启动子（polh-P）3）常采取转移载体与野生病毒体内重组方式构建重组病毒4) 重组病毒多角体蛋白基因的编码区被外源基因取代，丧失形成包涵体功能5）可以家蚕或昆虫细胞作表达宿主
优缺点：表达产物的修饰加工系统接近于哺乳动物，表达水平高，但生产成本高。 杆状病毒表达外源基因流程
亚克隆目的基因 与杆粒进行重组 分离重组病毒用于基因从大肠杆菌中分离重组杆粒，转染昆虫细胞
第七章 高等动物基因工程
高等动物基因工程
高等动物基因工程技术
转基因动物个体
高等动物细胞基因表达技术 动物工程动物工程细胞
高等动物细胞基因表达技术
哺乳动哺乳动物遗传性状改良生
物反应器大量生产有价值的蛋白
1、 基因导入细胞内的方法
物理方法：裸DNA直接注射、电穿孔、显微注射
化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子-质粒复合物法
生物学方法——动物病毒载体：腺病毒、 SV40、腺相关病毒、反转录病毒、人牛痘病毒、疱疹病毒等。
2、人腺病毒DNA载体 1)双链环状DNA病毒
2)腺病毒感染人体细胞是裂解型，不致癌 3)腺病毒可感染处于分裂期或非分裂期的细胞 4)不整合入基因组
缺点：免疫原性强、不能持久表达外源蛋白
SV40 DNA载体（双链环状DNA）
基因表达好 外源基因能高效表达
基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
蛋白多肽物质蛋白多肽物质大规模生产
宿主范围窄 只能转染猴细胞 装载量较小
反转录病毒（单链RNA病毒） 优点：
A、宿主范围广（几乎所有类型哺乳动物细胞）
B、效率高，可以感染大量的细胞，通常一次可以感染106～107细胞
C、外源DNA在整合时不发生重排，单位点、低拷贝整合（一般不超过5个） 缺点：
A、只感染分裂细胞
B、携带外源基因的长度有限(8kb)
C、载体病毒基因有潜在的致病性，如存在载体与人内源性逆转录病毒（HERV）序列间发生 D、重组而产生有感染能力的人逆转录病毒的潜在危险
3、动物转基因技术
转基因动物：是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。
转基因动物技术：是指借助基因工程技术将体外重组的结构基因导入受精卵或早期胚胎，培育出转基因动物的技术。
转基因动物的制作方法
一、受精卵雄原核显微注射法
二、胚胎干细胞（ES细胞）法：所得到的动物为嵌合体动物 三、逆转录病毒感染法 四、体细胞核移植法 五、精子载体法 六、YAC法
4、动物乳腺生物反应器
乳腺生物反应器：是基于转基因技术平台,使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺,利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。
乳腺生物反应器的原理
是应用重组DNA技术和转基因技术, 得到转基因乳腺表达的个体。外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区,即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列, 这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下,使其在乳腺中表达,再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。
常用的启动子
理论上讲任何乳蛋白基因的调控序列都能驱动外源基因在乳腺组织特异表达。 1、绵羊的球蛋白启动子(β-lactoglobulin ,BLG)
2、酪蛋白启动子：目前常用小鼠、山羊和牛的酪蛋白启动子 3、乳清酸蛋白（WAP）启动子：常用的有小鼠和兔的WAP启动子
5、哺乳动物细胞表达系统
优点：目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白
哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L 以上 缺点：
A、哺乳动物细胞的表达水平低
基因工程基础知识复习归纳 - 图文
