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5 ＤＮＡ和蛋白质技术 5.1 ＤＮＡ的粗提取与鉴定
1.提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。DNA的粗提取就是利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.DNA粗提取的原理：1）DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。所以一般选用2mol/L的NaCl溶液充分溶解DNA,使杂质沉淀，再缓慢注入蒸馏水使NaCl溶液浓度接近0.14mol/L，使DNA析出。2）DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。所以可用体积分数为95%,预冷的酒精溶液来提纯DNA。
3.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。1）酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。2）温度值为60～80℃时，会使蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。3）植物细胞提取DNA时，常用洗涤剂瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
4.在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，可以检测DNA的存在。
5.选用DNA含量相对高的生物组织提取DNA，成功的可能性更大。哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不适宜用来提取DNA，但适宜用来提取血红蛋白。
6.实验设计过程：1）实验材料的选取：本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为其DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。 2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：往鸡血细胞中加一定量的蒸馏水，同时用玻棒搅拌，使细胞吸水胀破释放DNA，过滤取DNA滤液。
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3）去除滤液中的杂质：往DNA滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，过滤除去不溶的杂质。再加蒸馏水调节NaCl溶液浓度接近0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质。
4）DNA的提纯：将析出的DNA用2mol/L的NaCl溶液溶解过滤取滤液，加入与滤液体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液，静置2-3分钟，析出白色丝状物即为粗提取的DNA。
5）DNA的鉴定：白色丝状物溶于5mL2mol/L的NaCl溶液，加入4mL二苯胺，沸水浴5分钟后观察到DNA溶液呈蓝色。
7.注意事项：在鸡血中要加入柠檬酸钠防止凝固；玻璃容器会吸附DNA，所以提取过程使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；加入酒精和用玻棒搅拌时，动作要轻缓（细胞破裂快速搅拌），沿同一方向搅拌，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要现用现配等。 5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
1. PCR又叫多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩张DNA片段的技术，其复制过程与细胞内DNA的复制类似。需要：1）解旋酶（打开DNA双链）；2）DNA母链（提供DNA复制的模板）；3）四种脱氧核苷酸（合成子链的原料）；4）DNA聚合酶（催化合成DNA子链）5）引物（使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸）。
2.为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（-OH）末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。
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3.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，须提供DNA模板、分别于两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸作为原料、耐热的DNA聚合酶、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
4.PCR一般要经历30多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步。变性指当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。复性指当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸指当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸（碱基为A、T、C、G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
5．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。在微量离心管中添加反应成分时，酶吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
6.DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用这一特点进行DNA含量的测定。
5.3 血红蛋白的提取和分离
1.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。血红蛋白由四条肽链组成，每条肽链环绕一个亚铁血红素基团。
2.根据蛋白质分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少，溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，来分离不同种类的蛋白质。
3.凝胶色谱法也称分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通精品文档
道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.缓冲溶液能在一定范围内抵制外界的酸和碱对溶液PH的影响，模拟细胞内的PH环境，维持蛋白质正常的结构与功能。血红蛋白的提取和分离所用的为20mmol/L磷酸缓冲液（PH为7.0）。
5.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电和负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
6.样品的处理及粗分离包括：1）红细胞的洗涤：洗涤的目的是去除杂蛋白。 2）血红蛋白的释放：加蒸馏水和甲苯，红细胞破裂，释放血红蛋白。 3）分离血红蛋白溶液：离心分层，取红色透明液体，就是血红蛋白水溶液 4）透析：把血红蛋白装入透析袋，置于20mmol/L磷酸缓冲液（PH为7.0）中，除去分子量较小的杂质。
7.用缓冲液平衡好的凝胶装填色谱柱时，要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。如果洗脱过程中红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。 8.血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
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