根据橘红2号不溶于水，易溶于芳烃类溶剂的特点，样品用丙酮-正己烷（1+3）混合溶剂提取并蒸发至干。用甲酸-乙腈（0.5+99.5）溶液(经正己烷饱和)溶解残渣，正己烷脱脂。在液相色谱C18反相柱上进行分离，在波长510 nm处检测，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
2、前处理条件
2.1 提取溶剂的选择：橘红2号与苏丹红1号染料的分子结构较为相似。由于果汁、果蔬中水分、水溶性物质较多，且橘红2号具有不溶于水的性质，参考国家标准GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法》，采用丙酮-正己烷(1+3)混合溶剂提取，再经液-液萃取与水相分离，能很好地去除水溶性杂质并把样品中柑橘红2号提取出来，试验选择丙酮-正己烷(1+3)混合溶剂作为提取溶剂，液-液萃取方法提取样品中柑橘红2号。
2.2净化条件的选择：由于用丙酮-正己烷(1+3)混合溶剂提取样品时，会同时提取出一些类脂物，为达到较好的净化效果，试验用甲酸-乙腈正己烷饱和溶液溶解残渣后，加入正己烷，采用甲酸-乙腈(0.5+99.5)溶液与正己烷液-液分配脱脂，试验结果表明，柑橘红2号的回收率理想，能较好地达到净化油脂的目的。
3、仪器分析条件 3.1色谱柱的选择
橘红2号具有不溶于水，易溶于芳烃类有机溶剂的特点，适用于反相液相色谱分析。标准中选用Zorbax SB-C18 3.5 μm 4.6 mm×150 mm的色谱柱，取得较好的分析效果。实际工作中可采用通用的液相色谱用C18反相柱进行分离。
3.2紫外吸收波长的选择
在色谱条件下对橘红2号标准溶液进行测定，结果表明，橘红2号在510 nm附近吸收最大，故标准中选择510 nm作为检测波长。
3.3 色谱条件的优化
橘红2号的化学结构与苏丹红1号较为相似，在C18柱上都有较强的保留。实验中采用乙腈与水以体积比90比10作为混合流动相，取得较好的分析效果。经空白样品与空白加标样品分析结果对比
4
表明，在橘红2号的出峰时间附近无明显干扰峰。
4、方法检出限
根据GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》中A.2色谱法中的计算方法： 检出限=S/b b－标准曲线回归方程中的斜率。 S—仪器噪声的3倍。 确认方法检出限为0.1 mg/kg。 5、回收率和精密度
根据GB/T 5009.1-2003，我们选用2个空白样品，分别加入三个水平的橘红2号标准溶液，按照送审稿的样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复6次，计算出每个添加水平的回收率和相应的相对标准偏差（RSD）值。方法回收率结果见表1，精密度见表2。
表1 不同添加浓度平均回收率（n=6）
样品名称 橙汁饮料 添加浓度（mg/kg） 0.30 1.00 5.00 0.30 1.00 5.00 回收率范围/(%) 90.0-103.3 90.0-101.0 94.4-96.8 83.3-90.0 92.0-98.0 94.8-97.0 平均回收率/(%) 95.6 95.7 96.0 87.2 94.7 95.7 果蔬汁 表2 吉林省产品质量监督检验院实验室内精密度
添加浓度/样品名称 （mg/kg） 0.30 橙汁饮料 1.00 5.00 0.30 果蔬汁 1.00 5.00 1 2 3 4 5 6 （mg/kg） 0.29 0.96 4.80 0.26 0.95 4.79 差 0.014 0.037 0.051 0.008 0.022 0.045 偏差/(%) 4.77 3.89 1.07 2.88 2.28 0.93 实测值/（mg/kg） 平均测定浓度/标准偏相对标准0.31 0.29 0.27 0.28 0.29 0.28 0.96 0.98 0.95 0.94 1.01 0.90 4.75 4.72 4.83 4.81 4.84 4.84 0.27 0.26 0.26 0.25 0.27 0.26 0.95 0.96 0.93 0.92 0.94 0.98 4.85 4.74 4.77 4.75 4.77 4.83 5
五、方法验证
1、验证方法
由我院统一制备果汁和果蔬汁样品，同时发送到3个参加方法验证的实验室进行验证，每个实验均对每个样品测定6次，结果见下表。
表3 检测机构1实验室内橘红2号的精密度
实测值/（mg/kg） 样品名称 添加浓度/（mg/kg） 1 2 3 4 5 6 平均测定浓度/（mg/kg） 平均回收率/(%) 标准偏差 相对标准偏差/(%) 0.30 果汁 1.00 5.00 0.30 果蔬汁 1.00 5.00 0.29 0.31 0.33 0.29 0.28 0.28 1.06 0.93 0.92 0.92 0.98 0.96 4.95 4.89 4.89 5.1 4.95 4.95 0.31 0.29 0.26 0.27 0.28 0.28 0.89 0.86 1.02 0.92 0.96 0.90 4.86 4.95 5.06 4.96 4.89 4.88 0.30 0.96 4.96 0.28 0.93 4.83 98.9 96.2 99.1 93.9 92.5 96.6 0.0197 0.0538 0.0769 0.0172 0.057 0.0770 6.63 5.60 1.55 6.12 6.18 1.59 表4 检测机构2实验室内橘红2号的精密度
实测值（mg/kg） 添加浓度/样品名称 （mg/kg） 1 2 3 4 5 6 度/（mg/kg） /(%) 0.30 果汁 1.00 5.00 0.30 果蔬汁 1.00 5.00 0.33 0.29 0.32 0.30 0.32 0.29 0.95 0.98 0.92 0.97 0.95 0.87 5.09 4.90 4.89 4.95 4.93 4.86 0.29 0.32 0.31 0.32 0.28 0.29 0.97 0.94 0.95 0.92 1.06 0.96 4.94 4.87 4.87 4.96 4.87 5.07 0.31 0.94 4.94 0.30 0.97 4.93 102.8 94.0 98.7 100.6 96.7 98.6 0.017 0.040 0.081 0.017 0.049 0.079 平均测定浓收率偏差 /(%) 5.59 4.26 1.65 5.71 5.05 1.61 平均回标准准偏差相对标 6
表5 检测机构3实验室内橘红2号的精密度
实测值/（mg/kg） 添加浓度/样品名称 （mg/kg） 1 2 3 4 5 6 度/（mg/kg） /(%) 0.30 果汁 1.00 5.00 0.30 果蔬汁 1.00 5.00 0.29 0.32 0.28 0.28 0.29 0.28 0.97 0.94 0.91 0.89 1.08 0.92 4.97 4.86 4.87 4.90 4.86 5.12 0.32 0.29 0.29 0.31 0.28 0.27 0.88 0.93 0.90 0.94 0.86 0.89 4.94 4.92 4.86 4.88 4.83 4.86 0.29 0.95 4.93 0.29 0.91 4.89 96.7 95.2 98.6 97.8 91.4 97.7 0.015 0.069 0.102 0.019 0.030 0.044 平均测定浓收率偏差 /(%) 5.34 7.20 2.07 6.35 3.32 0.91 平均回标准准偏差相对标 2、验证结论
经实验验证：检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定果蔬及果蔬汁中橘红2号的要求，其方法方便、快捷，应广泛应用。
3、实际样品测定
表6 实际样品测定数据汇总表
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 橘红2号/(mg/kg) ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 7
9 10 11 12 注：① “—”为未检出
---- ---- ---- ---- 六、征求意见情况及重大意见分歧处理结果
1、征求意见情况
本标准征求吉林省出入境检验检疫局、长春市产品质量监督检验院、吉林省农科院、中科院长春应用化学研究所等单位专家意见后，将结果汇总，共征求意见5个单位，返回5个单位，共征求意见17条，采纳15条，不采纳2条。
2、重大意见分歧处理结果 无重大意见分歧。
七. 实施标准的建议
1、《果蔬及果蔬汁中橘红2号的测定 高效液相色谱法》能够从根本上解决以橘红2号染料染色的“染色橙”或其它染色蔬菜及其下游产品的定性定量分析工作，填补了现有国家标准的空白。因此该方法具有重要的作用及价值，有必要强制使用。
2、为进一步提高检测效率，能够及时应对食品安全突发事件，维护广大消费者的利益，保护消费者身体健康，为执法机构的监督提供科学理论依据和技术支撑，本标准起草工作组通过搜集国内外相关法律法规以及检测方法，经过大量实验摸索，完成了标准的制定工作。
3、本标准主要用于监督抽查、风险监测及各种专项检查。 根据上述分析建议批准并发布。
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果蔬及果蔬汁中橘红2号的测定 高效液相色谱法 (编制说明)
