一种高效实现多片段插入的重组质粒的构建方法

联合运用融合PCR技术与无缝克隆技术成功构建出重组质粒（图2a）。首先将PL0007用BglⅡ/PstⅠ双酶切线性化，电泳结果表明线性化质粒大小与预期相符（图3），然后将目的片段应用infusion连接到PL0007质粒中得到重组质粒。经BglⅡ/PstⅠ酶切鉴定，电泳结果表明切开得到的一大一小两片段与预期符合（图3a）。测序结果与图谱吻合，无一位点发生突变(图3b)。将获得的重组质粒Ⅰ再以XhoⅠ单酶切并运用无缝克隆技术插入3‘UTR片段获得基因敲除重组质粒并酶切鉴定（图3）。

(a) (b)

（a）重组质粒Ⅰ：5’UTR、mouseMAGE-A3、gfp-3’pbdhfr/ts三片段插入5’端 （b）重组质粒Ⅱ：在质粒(a)的基础上插入同源重组序列3’UTR

图2 目的重组质粒图

M：1Kb DNA ladder 1：PL0007质粒BglⅡ/PstⅠ双酶切线性化大小为4306bp 2：PL0007质粒

图3 pl0007质粒BglⅡ/PstⅠ双酶切

M：1kb DNA ladder 1：酶切后插入片段大小为2969bp，载体大小为4309bp

图4 重组质粒ⅠBglⅡ/PstⅠ酶切鉴定

2.3重组质粒二（基因敲除重组质粒）的成功获得

将成功获得的重组质粒Ⅰ再以XhoⅠ单酶切并运用无缝克隆技术在重组酶的作用下将之前获得的3‘UTR片段插入目的位点，从而获得基因敲除重组质粒。分别以XhoⅠ单酶切鉴定以及BglⅡ/PstⅠ双酶切分别鉴定基因敲除重组质粒5’端和3’端插入序列的大小。（图3）

M1： DL2000 Marker; M2: 1Kb DNA ladder； 1： 重组质粒Ⅱ BglⅡ/PstⅠ双酶切结果两片段大小分别为2969bp和5068bp； 2：重组质粒Ⅱ XhoⅠ 单酶切结果两片段大小分别为759bp和7278bp。3：重组质粒Ⅱ。

图5 重组质粒Ⅱ(基因敲除质粒)的酶切鉴定

2.4 重组质粒插入片段的测序分析

将获得的含基因敲除重组质粒的三个单克隆菌落进行测序分析，结果表明。所有可靠序列均与NCBI基因序列相符，未见突变位点。应用软件进行序列对比在测序可靠部分完全一致（图六）。

图6 测序结果序列对比

图7 融合PCR反应原理

3、 讨论：

本实验成功构建出5’端多片段无缝插入质粒和基因敲除质粒（图1）。融合PCR反应分三步进行（图三），第一步分别以疟原虫基因组DNA、LLC细胞cDNA和PL0017质粒为模版独立扩增出三个片段。第二步将5’UTR和mouse MAGE3进行一次融合拼接。获得第一段融合片段5’UTR-mouseMAGE3。第三步将上一步获得的融合片段与gfp-3’pbdhfr/ts再进行一次融合PCR反应从而得到插入片段全长。应用融合PCR扩增的注意事项有：1、在引物设计时使待融合片段形成一定区域的互补序列，一般15-20bp可以满足要求，而引物的特异性结合区域（表中大小字母）的设计要遵循传统引物设计的一般原则。2、PCR反应中引物浓度不能太高，太高易产生非特异性扩增，也不能太低否则产量会下降。本次试验经对引物浓度进行多个梯度摸索最终确定2.5pmol引物能得到较高产量的特异性条带。3、酶的选择:本次分别以KOD FX、KOD Plus和ExTaq酶作比较，ExTaq因会在扩增片段3’端加上PloyA故不适合做融合PCR，本实验选用的DNA聚合酶KOD FX和KOD Plus均不会再扩增片段3’端加上PloyA，因此适合做融合PCR反应，但是考虑到要进行多轮PCR，为降低突变率故选用保真性更高的酶KOD Plus。4、用于回收待融合的凝胶中减少EB加入量，要求EB浓度低于0.15μg/ml。并且在胶回收时尽量避免紫外线的直接照射（切胶时垫一层PE塑料手套）减少紫外线的间接照射时间。避免EB和紫外线对模版的损害。

在复杂重组质粒构建方面本实验方法具有明显优势。第一、在载体构建方面联合运用融合PCR技术及无缝克隆技术构建重组质粒尤其适用于插入片段上酶切位点较多的情况。只需要载体上有一个特异性的限制性内切酶位点就可以将任何片段连接到载体上，同时还可以在插入片段两端实现少量碱基的插入从而人为地引入任意酶切位点，以及实现插入片段开放阅读框的调整。第二、该技术的灵活运用还可以实现对重组质粒的定点突变[7-9]。只需在设计时，把需要突变的位点设计到前后两待融合片段的引物的同源序列中，在第一轮PCR时将突变位点前后两片段独立扩增出来，再进行后面两轮PCR即可实现定点突变。第三、有效缩短重组质粒构建时间，传统的质粒构建方法的连接时间要十多个小时，在插入多个片段时要进行多次酶切、连接，构建一个三片段插入的重组质粒至少需要一个星期以上的时间。而本实验使用的融合PCR方法能在一天之内将三个片段连接到一起，而且当天就能完成无缝拼接并将重组质粒转化到感受态细胞中，第二天即可进行挑菌、PCR鉴定、摇菌、提取质粒、酶切鉴定。可在三天内完成复杂重组质粒的构建及鉴定。

目前重组质粒的构建已成为一项基本的分子克隆技术的，是进行基因的修饰、沉默、敲除等试验的基础[10, 11]。传统的质粒构建方法过多依赖载体和片段上的限制性内切酶位点，在拼接多个片段时需要精心设计酶切位点以及分多次连接，实现起来费时费力，大大降低了

试验效率。单独采用的融合PCR技术，进行了多轮PCR反应也有引入突变位点的可能性，而且所获得的线性化DNA片段不利于保存。在本次试验运用高保真聚合酶KOD Plus扩增3KB以下的片段选取了三个单克隆菌落测序未发现一例突变。我们有理由相信随着高保真聚合酶领域的快速发展，联合运用融合PCR和无缝克隆技术会成为快速高效构建复杂重组质粒领域的一项重要方法。