主要内容:
第一章 基因操作的基本技术
核酸制备；质粒及质粒载体；细菌的转化；凝胶电泳；核酸探针；限
制性内切酶、酶切图谱及分子克隆用酶
第二章 PCR技术
第三章 核酸分析与合成 第四章 噬菌体载体及粘粒
第五章 目的基因的准备和重组及重组子的鉴定 第六章 基因在原核及真核体系中的表达
真核基因在大肠杆菌中的表达；哺乳动物基因工程；研究DNA与蛋白
质相互作用的方法 第七章 植物基因工程 第八章 基因工程研究进展
人类基因组计划；基因诊断、基因治疗和转基因；反义技术 序言：
1.什么是基因工程？基因工程是如何诞生的？
答：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的宿主细胞中，并能持续稳定的繁殖。
2.基因工程的两个基本特征？
答：（1）跨越天然的物种屏障（2）确定的DNA扩增 3.基因工程的步骤和内容？
答：酶切分离目的基因→重组DNA分子→转移至受体细胞增殖→获得筛选目的重组子(→提取目的基因供进一步研究→重组目的基因功能表达) 4.基因工程可以应用于哪些方面?
答：(1)带来体外蛋白质化学的革命:甲型干扰素，红细胞生成素。
（2）对检测技术的贡献：提供大量高纯靶，提高准确性；病原体检出（HCV HBV HIV）；遗传病诊断。
（3）直接的遗传性疾病治疗和生物体改造：转基因动植物。
（4）促进对生命现象本质机理的研究：胰岛素基因与糖尿病、癌基因与抗癌基因。
5.什么是“安全”的宿主—载体体系？
答：失去自我迁移能力，可以是营养缺陷性，在自然环境下无法生存。 第一章 基因操作基本技术
1、提取细胞总RNA的原则是什么？如何实施？为什么? 答: 原则：抑制RNA酶活性
实施：（1）高温：180℃，2小时，灭活RNase
（2）二乙基焦炭酸乙酯（DEPC）,油状有毒, 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
（3）使用对RNase有强烈乙酯作用的细胞裂解剂，如盐酸胍、异硫氰胍（裂解细胞、抑制酶活性、解聚核糖体）
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（4）带手套、口罩：阻断RNA酶来源，加少污染机会。
（5）季节因素（温度）：RNase降解RNA温度高活性高，需要低温进行。 2.如何进行总RNA制品质量控制？ 答：
1）RNA的浓度和纯度测定
A260nm 1 OD=40 mg/ml RNA
要求 A260nm/A280nm=2.0 (1.7-2.0或>2.0) A260nm/A230nm >2.0 2）RNA的完整性
变性琼脂糖凝胶电泳检查 28S：18S?2：1 3）总RNA制品的保存
溶液法（TE或0.5%SDS 方便 但不稳定) 悬液法（溶液加3V乙醇 可靠 但不方便）
3.染色体DNA制备的原则是什么？各有哪些主要试剂？作用？ 答：原则：祛除蛋白及细胞碎片，祛除RNA，保持DNA分子完整。 主要试剂及作用：SDS（破坏细胞膜结构、变性蛋白质、解聚） EDTA（抑制酶活性）Proteinase K（蛋白酶消化蛋白质） 4.如何进行DNA样品的鉴定？
答： A260nm 1 OD=50 mg/ml DNA
要求 A260nm/A280nm >1.7 A260nm/A230nm >2.0
5. 有哪些方法可以进行DNA片段的制备？是如何进行的？
答：（1）低熔点琼脂糖（羟乙基 60°C-65 °C熔化，结果较纯） （2）透析袋法：需要把样品浓缩，把核酸沉淀，而去掉缓冲液。 （3）苯酚抽提法
（4）反复冻融法：多次冻融使凝胶收到破坏，释放其中DNA，但回收率低 （5）电洗脱法 （6）硝酸纤维素膜离心法（7）试剂盒 6.什么是质粒？质粒有几类？
答：质粒是一类亚细胞有机体，存在于细胞质中独立于染色体的遗传成分，由环状双链DNA组成的复制子。 分为：
①F质粒（致育质粒，可以通过接合，在供体和受体间传递遗传物质） ②R质粒（抗性质粒，带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗菌素产生抗性） ③Col质粒：带有编码大肠杆菌素的基因。
④降解质粒：可使宿主代谢特殊分子 ⑤侵入性质粒：使宿主菌具有致病能力 7.什么是质粒的转移？什么是质粒的迁移？迁移原理？
答：质粒的转移：从一个细胞自我的转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞去。
质粒的迁移：由共存的接合型质粒引发非接合型质粒的转移过程。
原理：当相容性的接合质粒和非接合质粒在同一细胞中，非接合质粒中mob编码的核酸酶作用其特异位点bom，使bom位点发生单链断裂而出现缺口，构象转变为缺口环状构象。当有接合性质粒中F因子能够导致性须的合成，
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提供转移装置，则可以转移。如果没有，缺口可能还原维持两种构象的动态平衡。
8.掌握质粒拷贝数的定义？质粒的复制类型？
答：定义：生长在标准培养条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。非标准培养条件下，每个细菌细胞染色体平均具有的质粒DNA分子的数目。
类型：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。 9.什么是质粒的不相容性？
答：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定存在。
10.掌握用作克隆载体的基本条件是什么？为什么？
答：(i) 具若干限制酶单一识别位点：可提供多种选择，具有多个同一种酶切位点则可能被切碎(ii) 具有复制起点：可导入宿主细胞，也是质粒自我增值必不可少条件（iii）具有选择标记：便于筛选（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数：操作简单，可携带较大片段的基因，并有利于载体的稳定。
11.掌握LacZ的筛选原理是什么？
答：是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
12、掌握以碱裂解法提取质粒主要用什么试剂？各有什么作用？几大步骤中各会发生怎样的现象？ 答：
溶液I（溶液呈黄色悬浊液）：葡萄糖（维持渗透压，保持结构完整性、用于悬浮）、Tris（维持一定粒子强度及PH值）、EDTA（螯合金属离子，抑制DNA酶的作用）。
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