第二十一章 临床免疫检验的质量保证
第一节 概述
一、定义 1.质量保证（QA）：为一产品或服务满足特定的质量要求提供充分可信性所要求的有计划的和系统的措施。
2.室内质量控制（IQC）：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，并确定当批的测定结果是否可靠，可否发出检验报告。
3.室间质量评价（EQA）：采取一定的方法，连续、客观地评价实验室测定结果与靶值的差异，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为实验室执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（PT）。
4.准确度：待测物的测定值与其真值的一致性程度。准确度不以数值表示，通常以不准确度来间接衡量。对一分析物重复多次测定，所得均值与其真值或参考靶值之间的差异亦即偏倚即为测定的不准确度。 5.偏倚：待测物的测定值与一可接受参考值之间的差异。偏倚又分批内偏倚和批间偏倚，批内偏倚反映的是系统误差，如校准不准、非特异显色等。批间偏倚问题要更大，如试剂或校准物变质所致的误差。 6.精密度：在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。以不精密度来间接表示。测定不精密度的主要来源是随机误差，以标准差（SD）和（或）变异系数（CV）具体表示。SD或CV越大，表示重复测定的离散度越大，精密度越差，反之则越好。准确度好的实验，其精密度不一定好；准确度差的实验，其精密度则不一定差；反之亦然。
7.重复性条件：是指在短的间隔时间内，在同一实验室对相同的测定项目使用同一方法和同一仪器设备，由相同的操作者获得独立的测定结果的条件。 8.批：在相同条件下所获得的一组测定。
9.均值：一组测定值中所有值的平均值，亦称均数。均值为计算值，在实际测定数据中可能会出现该数值，也可能没有。
10.标准差：为表示一组测定数据的分布情况，即离散度，可用标准差来表示。 11.变异系数：将标准差以其均数的百分比来表示，即为变异系数。
12.正态分布：当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。
二、实验方法诊断效率评价 1.诊断敏感性：是指将实际患病者正确地判断为阳性（真阳性）的百分率。本指标可用于评价测定方法的临床应用价值，理想测定方法的诊断敏感性应为100%。
2.诊断特异性：是指将实际无病者正确地判断为阴性（真阴性）的百分率。本指标是用于评价测定方法的临床应用价值，理想测定方法的诊断特异性应为100%。
3.诊断效率：是指能准确区分患者和非患者的能力。理想测定方法的诊断效率应为100%。
4.阳性预测值（PPV）：是指特定试验方法测定得到的阳性结果中真阳性的比率，理想测定方法的阳性预测值应为100%，亦即没有假阳性。
5.阴性预测值（NPV）：是指特定试验方法测定得到的阴性结果中真阴性的比率，理想测定方法的阴性预测值应为100%，亦即没有假阴性。
第二节 免疫检验的质量控制原则
一、标本的正确收集及处理 用于免疫检验的临床标本最为常用的是血清（浆）。对用于激素和治疗药物测定的血清标本，要注意收集时间甚至体位对测定结果的影响。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等检测的血清标本无此影响，但可能存在干扰因素。 （一）内源性干扰因素 包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。 1.类风湿因子（RF） 为避免RF的干扰，需采取： （1）改变标记抗体。
（2）标本中RF用变性IgG预先封闭：将经热变性（63℃，10分钟）的兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中，或是将该变性IgG连接至一颗粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入临床血清标本，反应后，再吸出标本进行检测。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG。 （3）测定抗原时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂如2-巯基乙醇。2-巯基乙醇等还原剂可使抗体内的巯基裂解，因而可以去除RF的干扰，但只适用于抗原测定。 2.补体 由补体引起的干扰可通过下述方法避免： （1）对临床血清标本加热灭活补体。 （2）包被或标记二抗使用特异的鸡抗体。
3.异嗜性抗体 人类血清中含有抗啮齿类动物（如鼠等）的Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。异嗜性抗体可通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假阳性反应。 （二）外源性干扰因素
包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、反复冻融和标本凝固不全等。
二、标准化操作及流程 在免疫测定中，操作步骤对测定结果会产生影响，测定的精密度是组成测定各步骤的变异和的平方根。改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，如加样、温育时间等。制定“标准操作程序”（SOP），且必须严格按相应的SOP进行操作，除非经实际工作证明正在使用的SOP中有不适当之处时，才可对SOP按一定程序进行修改。
三、标准品和质控品的应用 （一）标准品和质控品的分类
1.标准品 即含量确定的处于一定基质中的特性明确的物质，这种物质通常是纯品，可分为第一、第二和第三3个等级。
一级标准品数量有限，可使用10～20年，其为冻干品，内含载体蛋白。通常国际标准品（IS）为一级标准品。
国家标准品则为二级标准，可溯源至一级标准，二级标准可用来维持校准。 三级标准品则通过与二级标准的比对而来，为通常使用的商品校准品。
2.质控品 是含量已知的处于与实际标本相同的基质中的特性明确的物质，这种物质通常与其他杂质混和在一起，根据其用途可分为室内质控品、室间质评样本和质控血清盘3类。 （二）标准品和质控品的基本条件 1.标准品的基本条件
（1）标准品的基质通常为含蛋白的缓冲溶液，对测定结果无明显影响。 （2）对标准品的浓度一般无特殊要求，在方法的测定范围内即可。
（3）保持稳定性，在一定时间内，在规定的保存条件下应有良好的稳定性。
（4）无已知的传染危险性，对已知的经血液传播的病原体如HIV、HCV和HBV等必须作灭活处理。 （5）靶值或预期结果已定。 2.质控品的基本条件
（1）质控品的基质则应尽可能与临床常规实验中的待测标本一致。 （2）室内质控品则要求其所含待测物的浓度接近试验或临床决定性水平。 （3）良好的稳定性。
（4）无已知的传染危险性，对已知的经血液传播的病原体如HIV、HCV和HBV等必须作灭活处理。 （5）对于质控品，可单批大量获得。 （三）标准品和质控品的定值方法
决定性方法是指具有高精密度及没有系统偏差的参考方法。当没有决定性方法可使用时，则可确定一个参考方法。这种参考方法应有低测下限、不受非特异干扰及不与相关的化合物发生交叉反应，同时还应该容易得到。
（四）标准品和质控品的单位
目前可得到的国际标准品中特定分析物的浓度一般以IU/L表示，而已经很明确的物质如类固醇和甲状腺激素，则应以物质浓度（mol/L）表示。 （五）标准品值的溯源
从一级标准的值传递到最终试验所使用的校准物的过程通常由几个校准步骤组成，包括标准品和测定方法、缓冲液及其基质、稀释的控制、最终结果的统计学评价和质量控制等。当建立一个测定方法时，一级标准品的值要传递至二级、三级和（或）校准品，使得所建立的方法的测定值可溯源至一级标准品。 （六）与免疫测定标准品和质控品有关的组织机构
在国内免疫诊断试剂的审批由国家药品监督管理局（SDA）负责。卫生部临床检验中心也正在着手临床免疫检验标准化方面的工作。
实验室的环境、设施和设备：作为一个临床实验室，首先应有充分的空间、良好的照明和空调设备，这是保证检验人员做好工作的前提。实验室仪器设备应保养良好。 第三节 质量保证、室内质控和室间质评之间的关系
临床实验室免疫检验步骤基本上可分为标本收集、实验室测定过程和结果报告及其解释等。 IQC仅覆盖上述各步中的测定分析步骤；
EQA则除了监测测定分析步骤外，还包括一个较大范围的实验室活动，诸如在标本接收中样本处理的可靠性，以及测定结果的报告和解释。 第四节 常用免疫检验的质量控制
一、免疫检验质量控制中常用统计学方法的选择 统计学质量控制就是使用室内质控物与临床常规标本同时检测，然后根据室内质控物的测定结果，采用统计学的原理方法判断所进行的临床常规标本测定是否在控的一种质量控制措施。
（一）统计学质控的特点：临床免疫检验产生的检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以避免。
（二）基线测定：实验室在开展室内质控前，首先要进行实验变异的基线测定，亦即使用质控物确定实验在最佳条件和常规条件下的变异。
1.最佳条件下的变异（OCV）：是指在仪器、试剂和实验操作者等可能影响实验结果的因素均处于最佳时，连续测定同一浓度同一批号质控物20批次以上，即可得到一组质控数据，经计算可得到其均值（`X）、
标准差（s）和变异系数（CV），此CV即为OCV。
2.常规条件下的变异（RCV）：是指在仪器、试剂和实验操作者等可能影响实验结果的因素均处于通常的实验室条件下时，连续测定同一浓度同一批号质控物20批以上，即可得到一组质控数据，经计算可得到其均值、标准差和变异系数（CV），此批间CV即为RCV。
当RCV与OCV接近，或小于2OCV时，则RCV是可以接受的，否则，就需改进常规条件下的操作水平。 通常在免疫检测中ELISA测定的OCV应小于15%，使用自动化免疫分析仪的测定OCV则应小于10%。 基线测定还应包括批内变异的测定及对室内质控物的测定准确度的评价。测定准确度在定量测定是指批内和批间测定结果的均值与靶值的差异。在定性测定，则是指接近其测定下限的弱阳性样本批内和批间测定的结果是否为阳性。
（三）临床免疫检测质控图的选择、绘制及质控结果判断 1.Levey-Jennings质控图方法
IQC数据是用来控制实际过程的，因此其表达应清楚和直接，在质控图上记录结果时，应同时记录测定的详细情况，如日期、试剂、质控物批号和含量及测定者姓名等。 2.Westgard多规则质控方法
其主要特点有：①具有Levey-Jennings质控图方法的优点，可通过相似的质控图来进行分析；②假失控和假告警概率低；③误差检出能力增强，失控时，对导致失控产生的分析误差的类型有较强的辨别能力，从而有助于采取相应的措施进行改正。
其质控图的模式同Levey-Jennings质控图，只不过是在质控测定结果的判断上采用了多个质控规则。 免疫测定的测定范围通常较大，有的具有数个“临床决定性”水平，因此常有必要在每批测定中包括数个具有不同浓度（如高、中和低浓度）的IQC样本，由于免疫测定的标准差通常随浓度的增加而明显变大，使得具不同浓度的IQC样本无法在一个Levey-Jennings质控图上作图。Z计分质控图即可用于使用多个质控物进行质控的情况，使得在同一质控图上同时记录不同质控物的测定结果成为可能。 3.累积和质控方法
累积和质控方法对系统误差有较好的测出能力。 4.“即刻法”质控方法
“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，即Grubs异常值取舍法，只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。
二、定性免疫检验 主要有沉淀试验、凝集试验、荧光免疫试验、化学发光免疫试验和酶免疫试验等，此类测定的质控要点是测定下限，因此应选择靶抗原或抗体浓度接近试剂盒或方法的测定下限的质控品进行室内质量控制，并与临床标本的测定同时进行。
这一点对于使用肉眼判定结果的方法尤为重要。如自身抗体检测的荧光免疫试验，每次测定都应至少带一个已知的弱阳性对照，从而有助于判断临床标本的检测结果是否有效。
有些还须用高浓度质控品进行质控。如酶免疫试验中双抗体夹心模式中的一步法。 对于定性免疫检验来说，阴性质控是必需的。
三、定量免疫检验 主要有放射免疫试验、酶免疫试验和化学发光免疫试验等，后两者通常需要使用全自动免疫分析仪，由于其对测定结果要求有准确的量值，因此在测定时须用校准品对仪器进行校准，室内质控则应选择特定试剂盒或方法的测定范围内的高、中和低三种浓度的质控品，以监测对不同浓度标本的测定变化。
四、半定量免疫检验
主要有酶免疫试验、荧光免疫试验等，测定结果的判断通常为测定抗体的滴度、效价等。此类测定的质量控制要点是采用数个相应滴度或效价的抗体作为室内质控品，同时也需有阴性质控。 第五节 免疫检验室内质量控制的数据处理
一、室内质控数据的评价和管理 临床免疫检验常见失控原因有：①测定操作中的随机误差：如标本和试剂吸取的重复性差、试剂未混匀、洗涤不充分和温育时间及环境条件的一致性不佳等；②仪器的问题：如光路不洁、比色波长不对、管道堵塞等；③试剂的问题：如校准品不对或变质、显色底物变质、试剂受到污染和试剂因贮存不当失效等。
二、室内质控的局限性
IQC可确保每次测定与确定的质量标准一致，但不能保证在单个的测定样本中不出现误差。比如标本鉴别错误、标本吸取错误、结果记录错误等。此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，应均匀地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。
三、免疫检验质量保证的意义
临床免疫检验实验室的质量保证应该是实验室的一个核心活动，要做好质量保证，最重要的是必须要了解影响实验室测定质量的实验室过程的所有步骤，实验室测定过程中最薄弱的环节将反映实验室整个实验的质量。 【习题】 SOP文件是 A.操作程序 B.操作规程 C.标准操作方法 D.标准化操作程序 E.标准化的操作方法
『正确答案』D
『答案解析』SOP文件是：标准化操作程序。
某方法经反复测定得出的结果很接近于真值，说明该方法 A.准确度高 B.精密度好 C.灵敏度高 D.重复性好 E.实用性强
『正确答案』A
『答案解析』某方法经反复测定得出的结果很接近于真值，说明该方法准确度高。
有关标准品的要求，不包括在内的选项是 A.量值可溯源，准确性高 B.基质效应小 C.化学结构常见 D.无污染危险性 E.稳定性好
临床免疫学和免疫检验第二十一章 临床免疫检验的质量保证讲义
