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实验二 总RNA的提取和检测
实验目的
1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法;
2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法; 3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱;
实验原理
(一)概述
1. 10-5 μg RNA/细胞含有rRNA 80-85%:28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5%
2. mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构,可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
3.RNA分离的方法:异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,盐酸胍-有机溶剂法,氯化锂-尿素法,蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 4.目前常用的是Trizol法。 (二)Trizol的主要成分
1.Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂,主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,其主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。
2.酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相,RNA在上层水相
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中。
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4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA。 (三)总RNA的纯度检测原理:
不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收,光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。
因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/mL 的单链RNA。用PH=7.6 的TE(tris HCl缓冲液)稀释RNA样品n倍并以TE为空白对照,根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000
实验步骤
(一)样品处理与Trizol用量
1.提取组织RNA时,每50~100mg组织(即0.5×0.5×0.5cm,约合0.1cm3)用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;
2.悬浮细胞先离心沉淀,每5-10×106个细胞加1mL Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
3.培养贴壁细胞不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/mL比例加入。(注意:匀浆一定要彻底,是提取高质量RNA的前提;细胞数量与Trizol的比例,细胞的数量不能过多。) (二)操作步骤
1.细胞中加入1 mLTrizol用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后,室温放置5min,使其充分裂解。(注意:此时可放入-70℃长期保持)
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2.按200 μL氯仿/mL Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置2-3min。(注意:此步一定要振荡混匀,使氯仿和Trizol不分层)
3. 4℃12,000g离心5-10min。样品分为三层:底层为黄色(红或绿)有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用Trizol试剂的60%。
4.吸取上层水相,至另一新的离心管中。一般400-450μL就足够了,千万不要贪多!(注:千万不要吸取中间界面)
5.加入与水相等体积异丙醇后,上下颠倒混匀,4℃放置5 min。 7.4℃12,000g离心10 min,弃上清,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 8.加入1 mL 75%乙醇,(在沉淀对面管壁加入,切勿触及沉淀!)盖紧盖子后,温和转离心管1周,充分润洗管壁。 9.4℃12,000g离心5 min,尽量弃上清。
10..室温晾干或真空干燥5 min。(注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解) 11.加入适量冰冷无RNase的PEPC水(一般10 -20μL),充分震荡混匀,瞬时离心,备用。 (三)检测步骤
1.将提取的RNA,按1:20加入TE进行稀释
2.稀释过后用分光光度仪进行检测,先使用TE行进校对,空白对照,所有样品要先润洗三次之后,再加入50μL样液进行检测
3.可直接显示260nm下的OD值以及,260/280的对比结果
4.再将剩余未稀释的RNA提取液,进行琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性
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(具体琼脂糖凝胶电泳操作步骤见实验三)
结果与分析
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总RNA的提取和检测 实验报告
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