食品安全国家标准 金黄色葡萄球菌检验
1 范围
本标准规定了食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验方法。 本标准第一法适用于食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数。 2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.3 恒温水浴箱：37 ℃～65 ℃。 2.4 天平：感量0.1 g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。 2.9 无菌培养皿：直径90 mm。 2.10 L涂布棒。
2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3 培养基和试剂
3.1 7.5 %氯化钠肉汤：见附录A 中A.1。 3.2 血琼脂平板：见附录A 中A.2。
3.3 Baird-Parker 琼脂平板：见附录A 中A.3。
3.4 兔血浆纤维蛋白原（RPF）琼脂培养基：见附录A 中A.4。 3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录A 中A.5。
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3.6 兔血浆：见附录A 中A.6。
3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.7。 3.8 营养琼脂小斜面：见附录A 中A.8。 3.9 革兰氏染色液：见附录A 中A.9。 3.10 无菌生理盐水：见附录A 中A.10。
第一法 金黄色葡萄球菌定性检验
4 检验程序
金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。
检样 25 g(mL)样品+225 mL 7.5 %氯化钠肉汤，均质 36 ℃±１℃ 18 h～24 h a法 b法 Baird-Parker平板 RPF平板 36℃±１℃ 24 h～48 h 36℃±１℃ 24 h～48h 血浆凝固酶试验 溶血试验，涂片染色 报告 图1 金黄色葡萄球菌检验程序
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5 操作步骤 5.1 样品的处理
称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 5.2 增菌和分离培养 5.2.1 增菌
5.2.1.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长。
5.2.1.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板（a法）或RPF平板（b法），培养24 h。如果菌落不典型，可继续培养至48h观察。 5.2.2 分离培养
5.2.2.1 a法：金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有-清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。挑取上述可疑菌落进行鉴定（见5.3.1、5.3.2、5.3.3）。
5.2.2.2 b法：金黄色葡萄球菌在RPF平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环。挑取上述可疑菌落进行鉴定（见5.3.1、5.3.2）。 5.3 鉴定
5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为 0.5 μm～1 μm。
5.3.2 溶血试验：挑取Baird-Parker 平板或RPF平板上可疑菌落1 个或以上，分别划线接种到血平板上纯培养，36 ℃±1 ℃，18 h～24h。
观察菌落溶血情况，金黄色葡萄球菌在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。
5.3.3 血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker 平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝 块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌 株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培养18 h～48 h，重复试验。
5.4 葡萄球菌肠毒素的检验（选做）
可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌 肠毒素。 6 结果与报告 6.1 结果判定：
6.1.1 Baird-Parker 平板（a法）上的可疑菌落符合5.3.1、5.3.2、5.3.3，可判定为金黄色葡萄球菌。
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6.1.2 RPF平板（b法）上可疑菌落符合5.3.1、5.3.2，可判定为金黄色葡萄球菌。 6.2 结果报告：在25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法
7 检验程序
金黄色葡萄球菌平板计数法程序见图2。
检 样 25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质 10倍系列稀释 Baird-Parker平板计数法 RPF 平板计数法 选择2个～3个连续的适宜稀释度的选择2个～3个连续的适宜稀释样品匀液，接种Baird-Parker平板 度的样品匀液，接种RPF平板 36 ℃±1 ℃ 45h～48 h 36 ℃±1 ℃ 24h～48 h 计数及染色镜检、溶血试验和血浆计数及染色镜检、溶血试验 凝固酶试验 报 告 图2 金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序
8操作步骤 8.1 样品的稀释
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8.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
8.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
8.1.3 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
8.1.4 按8.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。 8.2 接种、培养
8.2.1 Baird-Parker平板计数法 8.2.1.1 接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。 8.2.1.2 培养
在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1 ℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ℃±1 ℃培养，45 h～48 h。
8.2.2 RPF平板计数法： 8.2.2.1 接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，吸取1 mL 空白稀释液加入无菌平皿内作空白对照。 8.2.2.2 培养
及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的RPF琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 待琼脂凝固后，翻转平板，置３６ ℃±１ ℃培养箱，培养２４ｈ～４８ｈ。
8.3典型菌落计数和确认
8.3.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有-清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。
8.3.2 金黄色葡萄球菌在RPF平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环。
8.3.3 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：
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