蛋白质的两性性质及等电点的测定
一 实验目的
通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理
蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除末端a－氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a－羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
RH3N+ROHCOOHHH3N+OHCOOHH2NRCOOH
HH在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。本实验采用酪蛋白在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备
(1) 试管架 1个
(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支
四 实验试剂
（1）1mol/L醋酸溶液：
量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL，加水至50 mL。 （2）0.1mol/L醋酸溶液：
量取1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL。
1 / 1
（3）0.01mol/L醋酸溶液：
量取0.1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL。 （4）0.2mol/L氢氧化钠溶液：
先称取氢氧化钠（分析纯）2g，加水至50 mL，配成1mol/L氢氧化钠。然后量取1mol/L
氢氧化钠10 mL，加水至50 mL，配制成0.2mol/L氢氧化钠。
（5）0.2mol/L盐酸溶液：
先量取37.2%盐酸（比重1.19）4.17 mL，加水至50 mL，配成1mol/L盐酸。然后
量取1mol/L的盐酸10 mL，加水至50 mL，配成0.2mol/L盐酸。
（6）0.01%溴甲酚绿指示剂：
称取溴甲酚绿0.005g、加0.29 mL 1mol/L氢氧化钠，然后加水至50 mL。 （7）0.5%酪蛋白溶液：
称取纯净酪蛋白0.25g放入50 mL容量瓶内，加水约20 mL，再准确加入1mol/L氢氧化钠5 mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L醋酸5 mL，最后加水稀释至50 mL，充分摇匀。
注：氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定。
五 操作步骤
1、蛋白质的两性反应
（1）取两支试管，加0.5%酪蛋白2 mL，再加溴甲酚绿指示剂4-5滴，摇匀。此时溶液呈兰色，无沉淀生成，说明了什么？
（2）用滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，随加随摇直至有明显大量的沉淀生成，此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点，观察溶液颜色有何变化？
（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少消失。观察此时溶液的颜色有何变化，说明什么？
（4）滴加0.2mol/L氢氧化钠进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L氢氧化钠液，沉淀又逐渐消失，从溶液的颜色变化说明什么？
注：溴甲酚绿的变化范围pH3.8-5.4。
2、蛋白质等电点的测定
取5支试管依次标号，按下列表格添加试剂，立即摇匀，观察混浊度。各管混浊度以-、±、+、++、+++表示。
指出酪蛋白的等电点。 试 编 剂 1 号 1.00 8.38 1.00 8.75 1.00 8.00 1.00 5.00 1.00 7.40 2 3 4 5 0.5%酪蛋白（mL） 蒸馏水（mL）
0.01mol/L醋酸（mL） 0.1mol/L醋酸（mL） 1mol/L醋酸（mL） pH 0分钟 观察 5分钟后 0.62 — — 5.9 — 0.25 — 5.3 — 1.00 — 4.7 — 4.00 — 4.1 — — 1.60 3.5 六 实验结果
1、解释上述实验反应的现象
2、指出酪蛋白的等电点
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蛋白质的两性性质及等电点的测定
