流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较

流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较①

蔡思齐 邓志辉

【摘 要】[摘 要] 目的：比较并优化流式细胞术检测人NK细胞体外细胞毒功能的方法。方法：采用Calcein-AM释放法或CFSE/7-AAD法分别对靶细胞进行标记，按10∶1和20∶1效靶比与7例NK细胞在37℃ 5%CO2培养箱共培养4 h，流式细胞术测定两种不同标记方法的靶细胞死亡率。结果：各实验组中CFSE/7-AAD法检出的靶细胞死亡率均高于Calcein-AM释放法，在低效靶比、弱细胞毒作用条件下，差异具有统计学意义。细胞毒作用较弱时，Calcein-AM释放法平均荧强度变化不显著、结果误差较大；而CFSE/7-AAD法则能更加敏感地检出靶细胞的死亡率。结论：CFSE/7-AAD法能够特异、灵敏地检出NK细胞的细胞毒活性，所获得的结果更为可靠。 【期刊名称】中国免疫学杂志 【年(卷),期】2019(035)003 【总页数】6

【关键词】[关键词] 流式细胞术；细胞毒作用；NK细胞；钙黄绿素乙酰甲酯；羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯；7-氨基-放线菌素D 【文献来源】

https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_chinese-journal-

immunology_thesis/0201270422375.html

·免疫学技术与方法·

①本文受国家自然科学基金资助(81373158)。

自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK cell)是机体天然免疫系统的重要组成部分，与抗病毒免疫、移植免疫、自身免疫疾病及肿瘤免疫密切相关。在多种细

胞因子(如IL-2、IL-15等)、饲养细胞(Feeder cells)的作用下，NK细胞可发生增殖和活化，分泌细胞因子和增强细胞毒功能。目前，NK细胞免疫治疗已成为细胞免疫治疗的重要方法，准确评价NK细胞的细胞毒活性，对评估病患免疫水平及细胞免疫治疗效果具有重要意义。

检测外周血或体外培养NK细胞介导的细胞毒效应，是评估NK细胞活性的主要方法，也是了解NK细胞功能最直接的方法。目前NK细胞活性检测的主要方法有：“金标准”51Cr释放法、LDH释放法、MTT法等。这些方法或存在放射性污染，或易受实验条件、操作者熟练程度干扰，重复性差；或者无法区分靶细胞和效应细胞死亡，不能很好地反映NK细胞的细胞毒功能水平。本文在已有方法的基础上，采用流式细胞术比较钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein-AM)释放法，及羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯/7-氨基-放线菌素 D(CFSE/7-AAD)双染色法检测体外培养后的NK细胞对K562细胞及白血病原始细胞的细胞毒活性，并对检测结果进行分析，为NK细胞毒活性检测提供一种较为稳定可靠、重复性好、灵敏度高的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 K562细胞株(深圳市汉科生物工程有限公司张明杰教授赠送)，白血病原始细胞留取自在深圳市血液中心进行骨髓移植HLA配型的白血病患者，NK细胞采自健康志愿献血者。按知情同意原则，所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂和仪器 X-vivo15培养液(瑞士Lonza公司)，RPMI1640完全培养液(美国Gibco公司)，人外周血淋巴细胞分离液[生工生物工程(上海)股份有

限公司]，抗人 CD56、CD3抗体(美国BD Pharmingen公司)，HANK细胞体外培养试剂盒(深圳汉科生物工程有限公司)，Calcein-AM(美国Thermo Fisher公司)，CFSE、7-AAD(美国BD Pharmingen公司)，恒温二氧化碳培养箱HF240(上海力申科学仪器厂)，TDL-400低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)，BD ACCURI C6流式细胞仪(美国BD Pharmingen公司)。 1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞分离与NK细胞培养 采集7名健康志愿献血者静脉血10 ml/人份，密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，用X-vivo15培养液重悬细胞，调整细胞密度为(1～2)×106 ml-1，于37.5℃、5% CO2 培养箱中平置培养13～14 d(HANK细胞体外培养试剂盒,按说明书使用)。使用抗人CD56、CD3抗体在BD ACCURI C6流式细胞仪上测定NK细胞(CD3-CD56+)含量。

1.2.2 白血病原始细胞的分离与处理 4例初诊、未经治疗的白血病患者的骨髓样本，采用人外周血淋巴细胞分离液分离获得白血病原始细胞，液氮保存备用。 1.2.3 两种方法检测7例NK细胞对不同靶细胞的细胞毒作用

1.2.3.1 Calcein-AM释放法检测NK细胞毒作用 取培养13～14 d的NK细胞及靶细胞，洗涤去除培养液，RPMI1640培养液调整NK细胞密度，备用。 Calcein-AM标记靶细胞：取PBS以24℃、300 g离心10 min，洗涤细胞2次，调整细胞密度为1×107 ml-1；加入终浓度为5 μmol/L的Calcein-AM，混匀，置于25℃、避光处孵育30 min。取出细胞，用RPMI1640完全培养液充分洗涤，并调整靶细胞密度为4×105 ml-1，备用。

效-靶细胞共培养：将处理好的效应细胞与靶细胞按不同的效靶比(20∶1、