第33讲 基因工程
[考纲要求] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.实验：DNA的粗提取与鉴定。
考点一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念 (1)供体：提供目的基因。 (2)操作环境：体外。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理：基因重组。 (5)受体：表达目的基因。 (6)本质：性状在受体体内的表达。
(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。 2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ③结果：产生黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 ②类型
常用类型 来源 功能 结果
E·coli DNA连接酶 大肠杆菌 只缝合黏性末端 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 缝合黏性末端和平末端 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 1 / 30
③DNA连接酶和限制酶的关系
归纳提升 与DNA相关的五种酶的比较
名称 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA (水解)酶 解旋酶 (3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 能自我复制??
②质粒的特点?有一个至多个限制酶切割位点
??有特殊的标记基因深化拓展 载体上标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 作用结果 将DNA切成两个片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
1．有关工具酶的判断
(1)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
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(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来( × )
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × ) (5)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × ) 2．有关载体的判断
(1)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × ) (2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点( √ ) (3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体( √ )
(4)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( √ ) (5)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( × )
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
提示 EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。 (2)以上实例说明限制酶有何特性？ 提示 说明限制酶具有专一性。
命题点一 工具酶的应用分析
1．下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( )
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A．HindⅢ B．EcoRⅠ C．EcoB D．PstⅠ 答案 C
解析 A处有3处(BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ)限制酶的切点，只有使用EcoB限制酶切割时，才能让目的基因插入到A处且使原有基因失活。
2．用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一个黏性末端)。
若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为( ) A．2.5和5.5 B．2.5和6 C．5.5和8 D．6和8 答案 D
解析 依图示可知，该质粒上有1个EcoRⅤ限制酶的切点、2个MboⅠ限制酶的切点，故用限制酶MboⅠ单独切割该质粒时，将产生长度为6和8的两种片段。
3．(2016·全国Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的
EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
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根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是______________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有______________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________________。 答案 (1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
解析 (1)分析图(a)可知，限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和
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高考生物大一轮复习第十单元现代生物科技专题第33讲基因工程学案
