内质网应激蛋白Xbp1在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制研究-细胞生物学专业毕业论文

内质网应激蛋白Xbp1在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制研究-细胞生物学专业毕业论文

山东大学硕_上学位论文

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Chinese Abstract．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．． ． ．．1 English

Abstract ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． ．5 Abbreviation．．．．．．． ．． ．． ．．．．．． ． ．．．．．．．．．．．．． ．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． ．．．．．． ． 10 ．．1 l Materials Introduction ． and Methods．． ．． ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．． ．．．．．．．． ．．． ． 14

Results ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．：18 Discussion．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．42 Conclusion ．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．． ．．．．．．．．．． ．． ．．．． ．45 Re：ference ． ． ． ．

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． ．Acknowledgment．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．． ．．．．．． ．． 50 Catalog ofPublication．．． ．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．51

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山东大学硕士学位论文

内质网应激蛋白Xbpl在果蝇饥饿过程中的功能及其 作用机制研究

研究生：崔上 专业：细胞生物学 导师：王向东教授 合作导师：刘勇教授

中文摘要

内质网(endoplasmic reticulum，ER)存在于真核细胞内，是细胞内分泌和跨膜蛋 白的合成、修饰加工及转运必须的细胞器。在特殊的环境条件下，当内质网腔内 的未折叠或错误折叠蛋白超过内质网的负荷时，细胞就会发生内质网应激(ER stress)。内质网应激一旦发生，内质网膜上的感受分子将激活一系列被称为未折 叠蛋白质反应(UPR，Unfolded 强

蛋白质处理能力或降低目的蛋白的合成以缓解压力。IREl．XBPl信号途径是UPR 反应中最为保守的一条通路。本实验室前期的一些研究结果发现，饥饿条件下， 小鼠肝脏中的IREI—XBPl信号通路能够被激活，并通过影响过氧化物酶体增殖 激活受体cL(PPARQ)的表达来调控饥饿引起的代谢反应。本文中将介绍，我们 采用果蝇作为模式动物，在果蝇及其幼虫的能量储存和代谢器官脂肪体中进行相 关实验，结果表明：内质网应激蛋白dXBPl通过诱导果蝇叉头框O型蛋白 (dFOXO)的降解减少饥饿条件下对脂肪的消耗，并延长果蝇在饥饿条件下的 寿命。我们的实验结果还证明内质网应激蛋白dXBPl对dFOXO的降解反应依 赖于蛋白酶体而刁i是经典的受胰岛素信号途径的调控。这些研究成果提示：内质 网应激可参与饥饿应答，调控饥饿条件下脂肪的动员。研究具有理论与实际意义。 研究目的：

研究内质网应激蛋白XBPl在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制。 研究方Protein Response)的信号通路来帮助内质网增法： 1．将对照组、dXbpl敲除组、dXbpls过表达组的果蝇和3龄幼虫分别予以正常

喂食和饥饿处理(果蝇饥饿48小时，3龄幼虫饥饿8小时)，处理结束后，

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取各组果蝇和幼虫的脂肪体组织进行尼尔红(Neil Red)染色，观察脂肪体中 脂肪的含量。使用三酰基甘油检测试剂盒和糖原检测试剂盒检测饥饿48小时 后果蝇体内的三酰基甘油水平和糖原水平。

2．将对照组、dXbpl敲除组、dXbpls过表达组的果蝇(每组分5培养管，每管

20只)予以持续饥饿处理，每12小时统计死亡果蝇数目，统计完毕后通过 Graphpad软件中的log—rank功能分析果蝇的存活率曲线，对比死亡一半时的 时间点探究各种基因型的果蝇对饥饿的耐受能力。

3．通过qPCR检测不同基因型果蝇在正常喂食和饥饿条件下与影响脂肪积累相 关的基因(FoxO，Bmm，4ebp，InR，Fas，HSL)的mRNA水平变化，初 步分析可能的机制。

4．通过对果蝇脂肪体细胞免疫荧光染色分析，以及使用蛋白免疫印迹(Western Blotting)法检测外源表达不同基因的果蝇S2细胞的蛋白样品等技术手段进 一步探究内质网应激蛋白XBPl调控果蝇饥饿应答的机制。

5．通过果蝇形态学观察，嵌合体表达染色等技术手段，探究dFoxO、dXbpl异 常表达对果蝇脂滴的积累以及果蝇幼虫的发育过程的影响。

研究结果：

1．dXbpl敲低组果蝇和3龄幼虫在饥饿条件下的脂滴含量较之正常喂食组均显 著降低。在三酰基甘油和糖原水平的检测实验中，饥饿条件下，dXbpl敲低 组的果蝇的三酰基甘油的下调较之正常喂食条件下更加显著。

2．持续饥饿条件下果蝇存活率检测实验结果显示，dXbpl敲低组的果蝇在第4．5 天时全部死亡，死亡一半的时间点(HalfLife Time)与对照组果蝇相比，差 异显著。dXbpls过表达组的果蝇在饥饿条件下存活时间为9．5天，死亡一半 的时间点与对照组相比显著升高。

3．qPCR结果显示，在饥饿条件下，果蝇体内dFoxO的mRNA水平在dXbpl 敲低和dXbplS过表达的情况下较之对照组均没有明显变化，但dFoxO下游 基因的mRNA水平在上述情况下均差异显著，其中Bmm的mRNA水平在饥

饿条件下，dXbpl敲低组较之对照组显著升高，与正常喂食条件下的显著下 降明显不同。HSL的mRNA水平在饥饿和正常喂食条件下在dXbpl不同表 达组间变化趋势大致相同。

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4．果蝇脂肪体细胞的免疫荧光实验结果显示，与正常喂食组相比，饥饿条件下 的果蝇脂肪体中的dFOXO蛋白在胞浆中的含量显著降低，在与dXBPls同时 过表达的情况下，dFOXO的含量显著降低。作为对照的mcd8没有发生明显 变化。 5．蛋白免疫印记法检测蛋白水平变化实验结果显示：dFOXO蛋白水平随着 dXBPls表达水平升高而降低，呈明显的负相关趋势；真核生物蛋白质合成抑 制剂放线菌酮(CHX)处理的时间相关性实验结果显示，经过CHX处理， dFOXO蛋白的稳定性较高，而dXBPlS的稳定性较低，同时存在的情况下， dXBPls仍然能够使dFOXO蛋白水平显著降低；在无MGl32处理的情况下， 过表达dXBPlS使dFOXO蛋白水平显著降低，而使用MGl32处理之后， dXBPls和dFOXO同时过表达的样品中，dXBPls的表达水平与无MGl32 处理的情况下无明显变化，但是，dFOXO的蛋白水平与无MGl32处理组相 比显著升高。在MGl32处理的情况下，dXBPls过表达导致的dFOXO降解 作用不明显；Insulin处理果蝇S2细胞使dFOXO表达量有所升高，但与 dXBPls共转后，dFOX0的降解作用并没有发生明显变化；Insulin与MGl32 同时处理S2细胞的结果显示，Insulin处理对于dFOXO的降解作用没有明显

影响。 6．dXbpl敲低导致果蝇脂肪体中脂滴含量显著减少，同时敲低dFoxO使脂滴含

量显著恢复：在正常喂食以及饥饿条件下，dXbpl敲低所导致的三酰基甘油 含量的减少均被dFoxO敲低所恢复；与对照组果蝇对比，Xbpl敲低组果蝇 抵抗饥饿的能力明显下降这一表型在同时敲低dFoxO的果蝇中得到了一定程 度的恢复，单独敲低dFoxO组的果蝇在饥饿条件下的存活能力则较之对照组 果蝇有所提高。

7．与表达GFP的对照组果蝇相比，dFoxO过表达的果蝇翅膀中，较上方的一条 纵向的短小横隔脉消失；同时过表达dXbpls，消失的短小横隔脉重新出现。 8．dFoxO过表达的果蝇幼虫发育缓慢且无法发育成成虫，同时过表达dXbpls 和dFoxO的果蝇幼虫与对照组相比发育缓慢，但仍能发育为成虫；同样饲养 条件下，15天时，dFoxO过表达组的幼虫几乎没有存活，同时过表达了dXbplS 组的果蝇幼虫数量较dFoxO过表达组显著增多。

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