葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在挑选致敏蛋白组分的应用

葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在

挑选致敏蛋白组分的应用

李雅莉，孙秀珍，高燕华，刘昀，张洁，冯向莉

【摘要】 目的 制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体，并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的挑选。方式 用葎草花粉变应原浸液免疫兔，取得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清，应用琼脂免疫双扩散、ELISA法和Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果 兔抗血清效价经ELISA检测，效价>1∶10000，免疫双扩散结果说明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线，Western blotting检测兔抗血清IgG能够特异性识别葎草花粉8种蛋白组分，分子质量别离为100、8八、7六、6九、6五、5五、4九、38ku，患者血清IgG能够识别5种蛋白组分，分子质量别离为100、7六、5五、4九、38ku。结论 制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性，应用该血清挑选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清挑选的组分相似，因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。

【关键词】 李雅莉，孙秀珍，高燕华，刘昀，张洁，冯向莉

在我国，葎草是仅次于蒿属的重要的夏秋季致敏花粉，受累人口众多。葎草花粉飘散的顶峰时刻较长，诱发的病症较重，患者常常要

求进行特异性免疫医治(specific immunotherapy, SIT)，并希望能长期医治。目前临床上利用的葎草花粉变应原浸液质量难以标准化，在诊断和医治方面存在很多不足的地方，而基因工程生产的重组变应原那么能够克服天然变应原浸液的局限性。国内外研究证明采纳构建cDNA文库、分离单一过敏原蛋白及氨基酸序列分析相结合的方式，是研究过敏原基因的首选方式。选择高效价的抗体作为挑选cDNA文库探针，是进行诊断和医治用重组变应原疫苗的前提。目前国内关于寄生虫cDNA文库的挑选多项选择用免疫动物血清[1

3]，而关于引发变

态反映性疾病的过敏原基因阳性克隆挑选多用患者血清[4]，未见有应用动物多克隆抗体和人抗血清同时挑选文库的报导。在已构建葎草花粉cDNA文库基础上，如何快速地挑选特异的致敏蛋白组分成为研究致敏原基因的关键。本文旨在比较兔抗葎草花粉多克隆抗体与人抗葎草花粉血清特异性识别抗原结果，挑选出葎草花粉致敏蛋白组分的快速而特异的方式，为重组葎草花粉变应原的生产和临床应用奠定基础。

1 材料与方式

材料

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，山羊抗人IgG(北京鼎国入口分装)，标准蛋白(Sigma公司)，PVDF膜(北京鼎国入口分装)。

5415D型高速离心机(德国eppendorf公司)，85

2型恒温

磁力搅拌器(常州国华电器)，Vcx 500型超声细胞粉碎仪(Sonics &MATERIALS)，全自动凝胶成像分析系统(美国Bio

Rad公司 Gel

Doc 2000)，POLARstar酶标仪(德国BMG 公司)，ＣＡＰ变应原体外检测系统(瑞典Pharmacia公司)，微型垂直电泳仪、转印仪(美国BioRad公司)，UV

3000紫外/可见分光光度计(日本岛津公司)。实

验动物：健康雄性白兔2只，体重，购自西安交通大学医学院实验动物中心。

血清搜集

阳性患者血清：临床上选择对葎草花粉变应原点刺实验(SPT)≥的过敏性哮喘患者10例，其中男5例，女5例，取静脉血3mL。分离血清后，用法玛西亚CAP变应原自动检测系统，搜集对葎草花粉变应原特异性反映阳性达2级或2级以上患者血清，分装后-70℃保留。阴性对照血清：4例无变态反映史健康人，各类变应原点刺实验阴性，取静脉血3mL，分离血清后，-70℃保留。

葎草花粉变应原浸液的制备

自然脱落法搜集葎草花粉，9号分样筛过筛，室温下乙醚脱脂。取脱脂花粉5g加Coca

s液100mL，超声粉碎(约150W，超声时

刻5s，距离5s，工作次数30次)后4℃下搅拌提取72h，4℃下13000