___________解磷菌PSBHY-3对池塘底泥的解磷效果___________

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（10）：2096-2102·2096·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com49卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.10.28解磷菌PSBHY-3对池塘底泥的解磷效果

胡晓娟，许云娜，胡百文，徐

煜，杨

广州

铿，文国樑，李卓佳，曹煜成*

（中国水产科学研究院南海水产研究所/广东省渔业生态环境重点实验室/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，

510300）

摘要：【目的】研究解磷菌PSBHY-3对池塘底泥的解磷效果，为解磷菌在养殖池塘中的推广应用提供参考依据。

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【方法】以模拟池塘环境系统为平台，探究不同浓度（10、10、10和106CFU/mL）PSBHY-3对池塘底泥的解磷效果；并在无菌池塘底泥水体系统中分别设P组（PSBHY-3）、D组（有机物降解菌De）、P-D组（PSBHY-3与De的初始菌量比1∶1）、P-3D组（PSBHY-3与De的初始菌量比1∶3）、3P-D组（PSBHY-3与De的初始菌量比3∶1）和对照组，分析PSBHY-3与De复配使用的解磷效果。【结果】至试验结束（第8d）时，与对照组相比，J-3（103CFU/mL）、J-4（104CFU/mL）、J-5（105CFU/mL）和J-6（106CFU/mL）组的池塘底泥总磷（TP）含量均显著降低（P<0.05，下同），对应的TP降解率分别为7.05%、6.60%、4.03%和9.17%。在PSBHY-3和De复配试验中，2株菌株间不仅未出现生长拮抗现象，还能促进De生长。至试验结束（第8d）时，各加菌组对池塘底泥TP的降解率均显著高于对照组，其中，以P组的TP降解率（8.17%）最高，而P-3D、P-D、D和3P-D组的TP降解率分别为5.38%、4.97%、4.38%和3.91%，各加菌组间均无显著差异（P>0.05）。经16SrDNA序列分析和Biolog微生物自动分析系统鉴定，确定PSBHY-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefa-ciens）。【结论】PSBHY-3为解淀粉芽孢杆菌，对池塘底泥沉积磷具有较好的降解效果，可作为研发水产养殖用解磷菌菌剂的备选菌株。

关键词：解磷菌；解磷效果；池塘底泥；有机物降解菌；复配使用中图分类号：S917.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2018）10-2096-07

Phosphatesolubilizingeffectsofphosphatesolubilizing

bacteriaPSBHY-3onpondsediment

HUXiao-juan，XUYun-na，HUBai-wen，XUYu，YANGKeng，

WENGuo-liang，LIZhuo-jia，CAOYu-cheng*

（SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences/KeyLaboratoryofFisheryEcology

andEnvironmentofGuangdong/KeyLaboratoryofSouthChinaSeaFisheryResourcesExploitation&Utilization，

MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Guangzhou510300，China）Abstract：【Objective】EffectsofphosphatesolubilizingbacteriaPSBHY-3onpondsedimentwerestudiedtoprovide

referencefortheextensionandapplicationofphosphatesolubilizingbacteriainponds.【Method】Basedontheplatformofsimulatedpondenvironmentsystem，phosphorusremovaleffectsofPSBHY-3indifferentconcentrations（103，104，105

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and10CFU/mL）wereexplored.Inthesterilemuddy-watersystemofpond，groupP（PSBHY-3），groupD（organicde-gradationbacteriaDe），groupP-D（PSBHY-3andDewithaninitialbacterialratioof1∶1），groupP-3D（PSBHY-3andDewithaninitialbacterialratioof1∶3），group3P-D（PSBHY-3andDewithaninitialbacterialratioof3∶1）andcontrolgroupweresetup，andthephosphatesolubilizingeffectsofcombineduseofstrainPSBHY-3andDewerestudied.【Re-sult】Comparedwiththecontrolgroup，thetotalphosphorus（TP）contentinthebottomsedimentoftheJ-3（103CFU/mL），

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J-4（10CFU/mL），J-5（10CFU/mL）andJ-6（10CFU/mL）groupsweresignificantlyreduced（P<0.05，thesamebe-low），andthecorrespondingTPdegradationrateswere7.05%，6.60%，4.03%and9.17%respectively.IntheexperimentofcombineduseofPSBHY-3andDe，twostrainsnotonlydidnotshowgrowthantagonism，butalsopromotedthegrowthofDe.Attheendoftheexperiment（the8thd），thedegradationrateofTPinthesedimentwassignificantlyhigherineachadditiongroupthanthatinthecontrolgroup.Amongthem，TPdegradationrateingroupPwasthehighest（8.17%），whilethoseingroupsP-3D，P-D，Dand3P-Dwere5.38%，4.97%，4.38%and3.91%respectively.Therewasnosignificantdifferenceamongeachadditiongroup（P>0.05）.ThestrainPSBHY-3wasidentifiedasBacillusamylliquefi-ciensby16SrDNAsequenceanalysisandBiologmicrobiologicalidentificationsystem.【Conclusion】StrainPSBHY-3isB.amylliqueficiens，whichhasagooddegradationeffectonTPinthebottomsedimentofpond.Anditcanbeusedasanalternativestrainoftheprobioticsofphosphatesolubilizingbacteriaappliedinaquaculture.

Keywords：phosphatesolubilizingbacteria；phosphorusremovaleffect；pondsediment；organicdegradingbac-teria；combineduse收稿日期：2018-04-22基金项目：广东省科技计划项目（2016A020210024）；国家现代农业（虾蟹）产业技术体系建设专项项目（CARS-48）；中国水产科

学研究院基本科研业务费专项项目（2017HY-ZD0501）；广东省渔港建设和渔业发展专项项目（A201701B06）

作者简介：*为通讯作者，曹煜成（1979-），博士，副研究员，主要从事水产健康养殖和养殖生态环境调控修复研究工作，E-mail：

cyc_715@163.com。胡晓娟（1984-），博士，主要从事养殖水环境与微生物调控研究工作，E-mail：xinr129@163.com

10期胡晓娟等：解磷菌PSBHY-3对池塘底泥的解磷效果

·2097·0引言

【研究意义】磷是养殖池塘微藻生长必需的营养元素之一（胡百文等，2014）。在养殖生产过程中，为营造优良的藻相和良好的生态环境，通常需施加磷肥以促进浮游微藻的生长（胡晓娟等，2010）；但磷元素进入池塘后大多成为难溶性磷沉积在底泥中，水体中的活性磷相对缺乏，致使水环境的磷养分利用效率低，形成磷限制潜在性富营养化（胡晓娟等，2017），同时带来池塘底质污染、水环境营养供给失衡等问题（刘孝竹等，2009）。因此，将底泥中的沉积磷适量释放并转化为活性磷，以满足水体浮游植物的生长需求，不仅能避免外源添加磷肥造成的浪费，还可促进池塘物质循环的高效运转，达到减轻池塘环境负荷及实现清洁生产的目的。【前人研究进展】微生物是控制和影响池塘底泥释磷效应的重要因素之一（GoedkoopandPettersson，2000；韩沙沙和温琰茂，2004），其中解磷菌（Phosphatesolubilizingbac-teria，PSB）具有将难溶性磷转化为可利用磷的能力Pérezetal.，2007；梁艳琼等，2011；Maitraetal.，2015）。长期以来，解磷菌在种植业中主要用于改善土壤磷素营养状况、提高磷素利用率和促进作物增产等（AmanullahandKhan，2015；Bakhshandehetal.，2015）。刘小玉等（2016）研究表明，从油茶根际土壤中分离筛选出的解磷菌4-Y-06在以蔗糖为碳源、硫酸铵为氮源、C/N为40∶1、pH7.0~7.5、30℃的条件下解磷效果最佳。张云霞等（2016）从磷矿土壤中筛选出1株高效解磷菌（BacillussubtilisJT-1），其解磷率高达38.69%，具有分泌苹果酸、延胡索酸、琥珀酸和柠檬酸等溶磷有机酸的特性，施入土壤后可有效提高土壤中可溶磷含量和土壤微生物群落结构的多样性。李海峰等（2017）研究表明，从土壤中分离获得的高效解磷菌株XMT-5在寡营养条件下可分泌柠檬酸、酒石酸和乙酸3种有机酸，环境适应能力较强，具有良好的应用前景。孟会生等（2017）研究证实，通过配施解磷菌肥能有效提高复垦土壤的有效磷含量。20世纪80年代，Jana和Patel（1984）首次调查了不同模式养殖鱼池的解磷菌数量，此后大量学者开始关注解磷菌在水产养殖中的应用效果，并开展相关研究。杨莺莺等（2015）从养殖池塘分离筛选出1株具有解磷能力的芽孢杆菌YC4，并研究其对养殖环境条件的适应性及解磷效果。胡晓娟等（2017）对比了4种典型虾池的磷含量和解磷细菌数量，结果发现不同类型虾池底泥中的总磷水平高，但水体中活性磷酸盐质量浓度较低，解磷细菌数量较少。【本

研究切入点】近年来，有关解磷菌的研究主要集中在

数量分布和分离筛选（WuandZhou，2005；林英等，2017），而解磷菌在养殖池塘环境中的应用效果及菌株复配效果评价鲜见报道。【拟解决的关键问题】以从对虾养殖池塘底泥中分离获得的解磷菌PSBHY-3为研究对象，在模拟池塘环境系统中探究不同浓度解磷菌对池塘底泥的解磷效果，并分析其与有机物降解菌复配使用的效果，为解磷菌在养殖池塘中的推广应用提供参考依据。

1材料与方法

1.1

试验菌株

解磷菌PSBHY-3筛选自凡纳滨对虾养殖池塘的底泥。前期研究表明，PSBHY-3对有机磷具有较好的解磷效果，培养9d后培养液中的磷酸盐含量可达118.9mg/L，明显高于对照组（6.36~7.16mg/L）（胡百文，2014）。有机物降解菌De由中国水产科学研究院南海水产研究所保存提供，为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）（曹煜成等，2010）。1.2

PSBHY-3在模拟池塘环境中的解磷效果在10L的整个箱底部铺设约4cm厚池塘底泥，注入800mL池塘水。根据PSBHY-3的初始施菌浓度设J-3、J-4、J-5和J-6组，对应的施菌浓度分别为103、104、105和106CFU/mL，同时设不施解磷菌的对照组。每组均设3个平行，30℃静置培养8d。于试验开始和结束时分别取样，按照国家相关标准测定底泥总磷（TP）含量（GB17378.5—2007）和水体活性磷含量（GB17378.4—2007）。其中，TP降解率（%）=（试验初始时的底泥TP含量-试验结束时的底泥TP含量）/试验初始时的底泥TP含量×100。1.3

PSBHY-3和De复配对池塘底泥的解磷效果分别取150g池塘底泥和300mL池塘水置于500mL三角瓶中，灭菌后备用。以1.2确定的施菌浓度为初始总菌量，分别设P组（PSBHY-3）、D组（De）、P-D组（PSBHY-3与De的初始菌量比1∶1）、P-3D组（PSBHY-3与De的初始菌量比1∶3）、3P-D（PSBHY-3与De的初始菌量比3∶1）组和对照组，每组3个平行。30℃下摇床（150r/min）振荡培养8d，每隔2d取样测定水体菌量和溶解性总磷（DTP）含量。其中，水体DTP增长率（%）=（试验结束时的水体DTP含量-试验初始时的水体DTP含量）/试验初始时的水体DTP含量×100。根据PSBHY-3和De在营养琼脂培养基上的菌落形态差异，分别计数PSBHY-3和De菌量。于试验开始和结束时分别取样测定底泥TP含量。

（·2098·南方农业学报49卷1.4菌株鉴定

1.4.116SrDNA序列分析采用TIANampBacte-riaDNAKit提取PSBHY-3总DNA，再对其16SrDNA片段进行PCR扩增。16SrDNA扩增采用的细菌通用引物为：8F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反应体系50.0μL，其中加入模板DNA2.0μL。扩增程序：95℃预变性4min；95℃1min，48℃1min，72℃2min，进行30个循环；72℃延伸10min。扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果用DNASTAR进行拼接，并在NCBI数据库中进行核酸数据比对分析，以获得同源性相近的细菌信息，确定其种属地位（Huetal.，2017）。

1.4.2Biolog微生物自动分析系统鉴定将PSBHY-3的单菌落接种至鉴定专用的BUG培养基上，30℃培养16~24h。待BUG培养基上长出可见菌落后，通过干管分散技术将其制成菌悬液，利用Biolog的浊度计，调整菌悬液浊度，再将菌悬液接种到BiologGP2微孔鉴定板上，30℃培养16~24h。期间通过PSBHY-3对95种碳源的利用情况及Biolog微生物全自动分析结果，基于菌株对不同碳源利用的生理生化特性将其鉴定到种的水平（Huetal.，2010）。1.5统计分析

采用Excel2010对数据进行整理及制图，并以SPSS17.0对数据进行显著性检验。

2结果与分析

2.1PSBHY-3在模拟池塘环境中对底泥的解磷效果

2.1.1底泥TP的变化情况在模拟池塘环境系统中，初始底泥TP含量为1490mg/kg；至试验结束（第8d），与对照组相比，施用不同浓度PSBHY-3对池塘底泥沉积磷均有降解效果，对应的TP含量均显著低于对照组（P<0.05，下同），尤以J-6组最低，为1353mg/kg（图1）。从TP降解率来看，以J-6组最高9.17%），其次是J-3组（7.05%）和J-4组（6.60%），J-5组（4.03%）最低。显著性检验发现，J-6组对池塘底泥沉积磷的降解率与J-3和J-4组无显著差异（P>0.05），但显著高于J-5组（图2）。

2.1.2水体活性磷的变化情况初始水体活性磷含量在1.26~1.30mg/L，至试验结束（第8d），与对照组相比，施用不同浓度PSBHY-3试验组的水体活性磷均有不同程度的升高（图3）。各解磷菌试验组的水体活性磷含量均显著高于对照组，尤以J-6组和J-3组较高，分别为2.54和2.35mg/L，较对照组提高2.02

１g）a第第0０　dｄDay　Ｄａｙ0０ktn第第8８　dｄDay　Ｄａｙ8８/ge１６１５０５００mid量（mebs含n１５ibcbcPtTn１４０５０c泥etn底o１４１３００５０c塘P池T１３０１２００２５０００对照Ｊ－３Ｊ－４Ｊ－５Ｊ－６组别Group图1各试验组池塘底泥TP含量的变化情况

Fig.1VariationofTPcontentinpondsedimentinpondeach

experimentgroup

同一时间图柱上的不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。图3和图5同

Differentlowercaselettersonthebarforthesametimerepre-sentedsignificantdifference（P<0.05）.ThesamewasappliedinFig.3andFig.5

tnem１ia）des１２０．００abniab率（%P解T８．００f降obe６．００PtTar泥no４．底itada２．００００rgeD０．．００００Ｊ－３Ｊ－４Ｊ－５Ｊ－６组别Group图2各试验组底泥TP降解率的变化情况

Fig.2VariationofdegradationrateofTPinpondsedimentin

eachexperimentgroup

图柱上不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。图6同

Differentlowercaselettersontherepresentedsignificantdiffe-rence（P<0.05）.ThesamewasappliedinFig.6

和1.83mg/L，但两组间无显著差异。考虑到当前的养殖应用实际，故在PSBHY-3和De复配试验中以103CFU/mL为初始施菌量。

re第第0t０　ｄ　ＤａawL）３第第8８　ddｄ　DayDayＤａｙｙ０0８8/ngiaatn２．００e量（mtnb含o２．cc磷eta１．５０００性hp活so１．d体hp水e０．５００liba０．０．５０００L对照Ｊ－３Ｊ－４Ｊ－５Ｊ－６组别Group图3各试验组水体活性磷含量的变化情况

Fig.3Variationoflabilephosphoruscontentinwaterineach

experimentgroup

（