实验二 动物蠕虫学粪便检查技术（二＞
一、 实验目地及要求
1、 掌握动物蠕虫学常见地实验室粪便幼虫培养及检查技术 2、 认识线虫幼虫和吸虫毛蚴等寄生虫幼虫地一般形态特征
二、 实验器材
载玻片，盖玻片，平皿，培氏皿，镊子，烧杯,塑料杯，塑料袋，漏斗，漏斗架，胶帽吸管离心管试管，玻璃棒， 纱布,脱脂棉，粪筛,锦纶筛＜260目/英寸），搪瓷缸，三角量筒，三角烧杯，胶塞,表玻璃，酒精灯，平底孵化 瓶，贝尔曼氏装置 ＜乳胶管二端分别连接漏斗和小试管） 球计数板，普通温箱，光学显微镜等? b5E2RGbCAP
碘液，家畜新鲜粪便等?
，显微镜测微器 ＜ 目镜测微尺、物镜测微尺），血
三、 实验方法、步骤和操作要领 ＜幼虫培养法、毛蚴孵化法、幼虫分离法、寄生虫学测微法）
＜一）幼虫培养法 ＜Technique for the Culture of Third-stage Larvae
） piEanqFDPw
圆线目中有很多线虫地虫卵在形态结构上非常相似 ，、难以进行鉴别.有时为了进行科学研究或达
.另外,做
到确切诊断目地，可进行第三期幼虫地培养,之后再根据这些幼虫地形态特征进行种类地判定 人工寄生性线虫感染实验时 ，也要用到幼虫培养技术.（图2-1＞DXDiTa9E3d
幼虫培养地方法很多，这里仅介绍最简单地一种■即：取新鲜粪便若干，弄碎置培养皿中央堆成半球 状,顶部略高出，然后在培氏皿内边缘加水少许
＜如粪便稀可不必加水），加盖盖好使粪与培氏皿接触.放
入25?30C地温箱内培养 ＜夏天放置室内亦可）.每日观察粪便是否干燥，要保持适宜地湿度.约经7? 15 天,第三期幼虫即可出现 ＜Egg-L1-L2-L3）,它们从粪便中出来，爬到培氏皿地盖上或四周.这时，我们可 用胶帽吸管吸上生理盐水把幼虫冲洗下来
，滴在载玻片上覆以盖片，在显微镜下进行观察■ RTCrpUDGiT
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图2-1马属动物圆线虫第三期幼虫
1.马圆线虫
2.
普通圆线虫
3.无齿圆线虫
4.小型圆线虫
培养幼虫时如无培氏皿 ，可用一大一小二个平皿来代替 ，将小平皿 <去掉盖）加上粪便放于大平皿
，效果更好.
中央，大平皿内加少许水，然后用大平皿盖盖上，即可进行培养.也可用两个塑料杯来培养幼虫
即先将一个塑料杯 <上大下小）一截为二，较小地底部用针扎许多小孔，装满待培养粪便，上用双层纱布蒙 上，再把截下地那部分套上 <头向下），使纱布绷紧；然后在另一个塑料杯内加少量水 套在该杯上 < 纱布面朝下），外面套上塑料袋进行培养即可 便地小杯放在分离装置地漏斗上
，把需培养地粪便杯
?培养好后，用幼虫分离法分离幼虫?即把装粪
< 用水冲洗几次）?注
< 用三角量筒也可），同时把塑料杯内地水也倒入
意在放培养物时务必小心，不要使粪便散开.jLBHrnAlLg
<二）毛蚴孵化法 ） ，进 毛蚴孵化法是专门用来诊断血吸虫病地 ，其原理是将含有血吸虫卵地粪便在适宜地温度条件下 行孵化，等毛蚴从虫卵内孵出来后，借着蚴虫向上、向光、向清地特性 ，进行观察，做出诊断?方法有多种 如常规沉淀孵化法、棉析毛蚴孵化法、湿育孵化法、塑料杯顶管孵化法、尼纶筛网集卵孵化法等 只介绍其中两种方法?（图2-2> XHAQX74J0X ，这里 图2-2 塑料杯顶管装置及尼纶筛网示意图 1.常规沉孵法 <又称沉淀孵化法或沉孵法）?取粪便100g,放入搪瓷缸内捣碎?加水约500 ml,搅拌 均匀，通过 粪筛滤入另一个容器内，加水至九成满，静置沉淀，之后将上清液倒掉，再加清水搅匀，沉淀?如 此反复3?4次?第一次沉淀时间约为30分钟左右，以后20分钟即可?最后将上述反复淘洗后地沉淀材料加 30C地温水置于三角烧杯中，瓶口用中央插有玻璃管地胶塞塞上 <或用搪瓷杯加硬纸片盖上倒插试管地 办法）?杯内地水量以至杯口 2cm处为宜，且使玻璃管或试管中必须有一段露出地水柱 ，之后放入25C? 30C地温箱中孵化?半小时后开始观察水柱内是否有毛蚴；如没有 ，以后每隔1小时观察一次，共观察数 次?任何一次发现毛蚴，即可停止观察?（图2-3> LDAYtRyKfE 图2-3 沉孵法装置示意图（引自Yang, 2005> 毛蚴似针尖大小地白色虫体 ，在水面下方4cm以内地水中作快速平行直线运动 时,可用胶帽吸管吸出在显微镜下观察 ，或沿管壁绕行?可疑 ?有时混有纤毛虫，其色彩也为白色，须加以区别?小型纤毛虫呈不 ＜体大、呈透明地片状）呈波浪式或翻转运动 .（图2- 规则螺旋形运动或短距离摇摆；大型纤毛虫 4＞Zzz6ZB2Ltk dvzfvkwMI 图2-A.东毕吸虫虫卵 1.原肠2.头腺3.侧穿入腺管 血吸虫虫卵及毛蚴 日本血吸虫虫卵 C. 日本血吸虫毛蚴 B. 4. 烟细胞5.神经结 6.肠细胞7.纤毛8.排泄孔 也可用锦纶筛 ＜筛绢孔径为260目 /英寸）集卵地办法来取代上述地反复水洗沉淀过程 地粪渣再进行孵化.rqyn14ZNXI 2.棉析毛蚴孵化法 ＜简称棉析法）.取粪便50g,经反复淘洗或锦纶筛淘洗后 ，对洗后所剩 ＜不淘洗也可），将粪渣 ，大小以塞住瓶颈 移入300ml地平底孵化瓶中，灌注25C地清水至瓶颈下部，在液面上方塞一薄层脱脂棉 下部不浮动为宜，再缓慢加入20C清水至瓶口 1?3mr处.如棉层上面水中有粪便浮动，可将这部分水吸去 再加清水.然后进行孵化.（图2-5＞ EmxvxOtOco 图2-5 棉析法装置示意图 1.水平面2.棉花3.浊水层4.粪渣 这种方法地优点是粪便只需略微淘洗或不淘洗就可装瓶孵化 ，毛蚴出现后可集中在棉花上层有限地 清水水域中，可和下层混浊地粪液隔开，因而便于毛蚴地观察.SixE2yXPq5 ＜三）幼虫分离法 ＜Baermann's Technique ） 本法又称为贝尔曼氏法.主要用于生前诊断一些肺线虫病 .即从粪便中分离肺线虫地幼虫 ，建立生前 诊断.也可用于从粪便培养物中分离第三期幼虫或从被剖检畜禽地某些组织中分离幼虫 .（图2-6＞ 6ewMyirQFL 图 2-6 贝尔曼氏幼虫分离装置示意图 操作方法：用贝尔曼氏装置进行 ?即用一根乳胶管二端分别连接漏斗和小试管 ，然后置漏斗架上，通 过漏斗加入40C地温水，水量约达到漏斗中部.之后漏斗内放上置有被检材料地粪筛 ?静置1小时后，拿 下小试管,吸弃掉上清液,吸取管底沉淀物,进行镜检.kavU42VRUs 也可以用简单地平皿法来分离幼虫；即取粪球 3?10个，置于放有少量热水 ＜不超过40 C）地表玻 璃或平皿、培氏皿内，经10?15分钟后，取出粪球，吸取皿内地液体，在显微镜下检查幼虫.y6v3ALoS89 ＜四）寄生虫学测微法 ＜Micrometry in Parasitology ） 图2-7 显微镜测微器构造示意图 显微镜测微器是在光学显微镜下测量细菌、细胞、寄生虫卵、幼虫、某些成虫、原虫等大小地仪 器.它由二件组成：一是目镜测微尺 ，一是物镜测微尺?目镜测微尺为一圆形小玻璃片 ，使用时装在目镜 里.它地中央刻有100等分地小格，每5个和10个小格之间有一稍长线或长线相隔 没有绝对长度地意义，是随着目镜和物镜倍数地不同和镜筒地长短而变化地 ?这些小格在镜下并 ?因此,在测量前须用物镜测 ?物镜测微尺为一个 微尺在各种不同放大倍数地目镜和物镜地搭配下测出目镜测微尺每一刻度地绝对值 特制地载玻片，其中央有一黑圈 碱是一个圆玻璃片，上有黑圈），在圈地中间有一长为 1mm黄线,被平均 分成100格，每5格和10格之间有一稍长线或长线相隔 7>. M2ub6vSTnP ?每格为0.01mm或10卩，这是绝对长度.（图2- 使用时，将目镜测微尺放于接目镜内 ，物镜测微尺放在载物台上 ?然后用低倍镜调节焦距，使目镜测 微尺和物镜测微尺地零点对齐 ，再寻找目镜测微尺和物镜测微尺较远端地另一重合线 ，算出目镜测微尺 地几格相当于物镜测微尺地几格 ，从而计算出目镜测微尺上每格地长度 ，以后测量时，只用目镜测微尺量 度就可以了 ?为了便于计算，可将目镜测微尺在固定显微镜和固定倍数物镜下地 好，列于卡片上，具体测量时，一查便知? OYujCfmUCw 在没有物镜测微尺时，可以用血球计数板代替使用?以该板内1个小方格地长度为标准，即可按上述 方法测出目镜测微尺每 1格地微M数 ? eUts8ZQVRd 用目镜测微尺测量虫卵大小时，一般是测量虫卵地最长和最宽处，圆形虫卵则是测量直径；测量幼虫 和某些成虫时，是测量虫体地长度、宽度及各部构造地尺寸大小；虫体弯曲时 办法，来进行分段测量，最后将数据加起来即可?（图2-8> sQsAEJkW5T ，可通过旋转目镜测微尺地 0?9格地长度事先计算 图 2-8 测微尺测量虫卵示意图 <引自Thienpont et al, 1986 ） 四、实验注意事项 1 ?幼虫培养法?如果是为了研究某种蠕虫卵或幼虫地生物学特性 ，那就必须先将患畜粪便用蠕虫卵 ，放于培氏皿内，在25?30 C 检查法或蠕虫幼虫检查法加以处理 ，然后将同种地虫卵或幼虫搜集在一起 ? GMslasNXkA 地温箱中进行培育?培氏皿内须预先放好培养基 对于吸虫卵、绦虫卵、棘头虫卵和大多数线虫卵 ，可用水或生理盐水做培养基 ?最好地培养基是灭 ，可以直接将培育有虫卵或幼虫地平皿放 100 c地温度下煮沸两小时?粪汁接 菌地粪便或粪汁，尤以后者为佳?因为用粪汁培育虫卵或幼虫时 于显微镜下，观察虫卵或幼虫地发育情况?粪便和粪汁地灭菌方法是 种虫卵或幼虫之前，须先用棉絮过滤? TlrRGchYzg
二动物蠕虫学粪便检查技术(二)
